Metileno mėlynasis kaip anaerobiozės ir deguonies indikatorius: ką įrodo spalvos pokytis

Laborantė sandariai uždaro anaerobinį indą, pro dangtį patikrina metileno mėlynojo indikatoriaus juostelę ir pamato tai, ką norėjo pamatyti. Mėlyna juostelė tapo balta. Ji užregistruoja, kad bandymas vyko anaerobinėmis sąlygomis, ir tęsia darbą. Po dviejų dienų vienoje lėkštelėje niekas neauga, o sandariame mėgintuvėlyje su sultiniu tame pačiame inde matyti deguonies poveikio požymių. Juostelė rodė tiesą. Laborantė jai uždavė netinkamą klausimą.

Ši painiava kyla dėl sąvokų. Metileno mėlynojo anaerobiozės indikatorius susijęs su redoksu, o ne su sterilumu ar visos sistemos validavimu. Aiškiai supratus šį skirtumą, juostelė tampa tikslia ir patikima priemone, atliekančia siaurą užduotį.

Veikimo principas: grįžtamoji redokso pora

Ištirpęs metileno mėlynasis būna dviejų būsenų. Oksiduota forma yra gerai pažįstamas mėlynas katijonas. Redukuota forma, vadinama leukometileno mėlynuoju, yra bespalvė. Esant beveik neutraliam pH, supaprastintoje pusreaktėje vienas mėlynas katijonas, vienas protonas ir du elektronai sudaro vieną bespalvę leukoformos molekulę. Esant pH 7, formalusis potencialas yra maždaug plius 11 milivoltų standartinio vandenilio elektrodo atžvilgiu. Taigi jis patenka į intervalą, kurį gali pasiekti daugelis redukuojančių sistemų ir kuriame deguonis gali sukelti atvirkštinį virsmą.

Redukcijai reikia žemo vietinio redokso potencialo. Vien pašalinti deguonį ne visada pakanka. Ankstyvaisiais anaerobiozės tyrimais nustatyta, kad metileno mėlynasis paprastame vandenyje be deguonies išlaikė spalvą, jei nebuvo redukuojančios medžiagos, o dekstrozės sultinio mišiniai su maždaug 0.01 procento dažiklio lengvai prarasdavo spalvą esant 37 C, nors tas pats mišinys, laikomas 4 C temperatūroje, išlikdavo mėlynas parą. Tai aprašyta eksperimentuose su šviežiais audiniais ir anaerobinio kultivavimo sąlygomis. Temperatūra, pH, gliukozė, askorbatas, tioglikolatas ir mikroorganizmų redukuojamasis aktyvumas lemia, ar elektronai yra prieinami.

Pakartotinei oksidacijai pakanka deguonies. Orui pasiekus leukoformą, ji vėl tampa mėlyna. Šiuolaikiniuose specialiai sukurtuose indikatoriuose naudojamas būtent šis ciklas: dažiklis, reduktorius ir stabilizuojanti matrica, kurie esant mažai deguonies tampa bespalviai, o paveikti oro vėl pamėlynuoja. Tai parodyta hibridinio metileno mėlynojo deguonies indikatoriaus, sudaryto iš dažiklio, reduktoriaus, paviršinio aktyvumo medžiagos ir molio, tyrime. Šiame prototipe naudotas 0.01 milimolinės koncentracijos dažiklis su 2.0 milimolinės koncentracijos askorbatu arba gliukoze, esant pH 11. Jis tapdavo bespalvis, kai deguonies buvo maždaug 0.5 tūrio procento, ir bandymo kameroje leido atskirti mažesnę nei 0.1 procento deguonies koncentraciją nuo didesnės nei 0.5 procento.

Taigi veikimo principas paprastas. Mėlyna spalva reiškia, kad indikatoriaus zona yra oksiduota. Bespalvė būsena reiškia, kad indikatoriaus zonoje susidarė redukuojančios sąlygos ir mažas deguonies kiekis. Pokytis yra grįžtamasis, vietinis ir cheminis. Pats savaime jis nieko nepasako apie mikroorganizmus.

Kaip metileno mėlynojo indikatoriaus juostelė veikia anaerobiniame inde

Metileno mėlynojo indikatoriaus juostelė anaerobiniam indui yra nedidelė reakcijos zona, įdedama į indo dujinę erdvę taip, kad ją būtų galima matyti neatidarius indo. Komerciniai formatai skiriasi: popierinės juostelės, ruošiant sistemą ištirpinamos arba sudrėkinamos tabletės ir naujesnis hibridinis indikatorinis popierius. Kai kurių reakcijos zonai aktyvinti reikia vieno lašo distiliuoto vandens. Kiti yra sausieji indikatoriai, kurie turi likti sausi. Vadovautis reikia konkretaus gaminio instrukcija, nes drėkinimas, padėtis ir rodmens vertinimo laikas yra cheminio proceso dalis.

Praktiškai rodmuo vertinamas kaip viena iš dviejų būsenų. Mėlyna spalva reiškia, kad ties juostele tebėra deguonies arba sąlygos nėra pakankamai redukuojančios. Balta arba bespalvė būsena reiškia, kad ties juostele susidarė anaerobinės redokso sąlygos. Į kai kuriuos komercinius indikatorinius popierius dedama raudono foninio pigmento, todėl jų galutinė redukuota būsena būna rožinė, o ne balta. Prieš vertindami savo gaminį, išsiaiškinkite, kokia galutinė būsena jam numatyta.

Laikas priklauso nuo sistemos. Vienoje GasPak tipo sistemoje spalva pradėjo blukti maždaug per valandą ir visiškai išbluko per kelias valandas, o kontroliuojamame palyginamajame bandyme kambario temperatūroje metileno mėlynajam prireikė daugiau nei šešių valandų. Tame tyrime terpių redokso potencialas per 60–100 minučių pasiekė maždaug minus 100 milivoltų, gerokai anksčiau, nei dažiklis baigė keisti spalvą, o juostelei tapus visiškai bespalvei buvo gerokai žemiau minus 200 milivoltų. Indikatoriaus reakcija atsilieka nuo atmosferos pokyčių. Mėlyna juostelė po vienos valandos neįrodo nesėkmės, o balta juostelė po šešių valandų apibūdina juostelės būseną būtent tuo metu.

Dėl tos pačios priežasties svarbi ir juostelės padėtis. Laikykite ją dujinėje erdvėje, matomą pro dangtį, atokiau nuo agaro paviršių ir kultivavimo terpių. Ji rodo savo artimiausios aplinkos sąlygas. Priglaudus ją prie šaltos sienelės, paslėpus po lėkštelėmis ar leidus jai permirkti kondensatu, ji rodys tos mikroaplinkos, o ne indo sąlygas.

Ką juostelė atskleidžia ir ko neatskleidžia

Anaerobinio indo metileno mėlynojo indikatorių laikykite vienu jutikliu vienoje vietoje. Jis parodo vietines redokso ir deguonies sąlygas savo reakcijos zonoje. Jei dujos pakankamai susimaišo ir sąlygos nusistovi, šis rodmuo iš esmės atspindi dujinės erdvės būseną. Visa kita yra išvados, kurioms reikia atskirų įrodymų.

Bespalvė juostelė nepatvirtina sterilumo. Sterilumas yra gyvybingų organizmų nebuvimas, patvirtinamas validuota sterilizacija ir kultivavimo validavimo kontrolėmis. Indas gali būti visiškai anaerobinis ir vis tiek užterštas arba visiškai sterilus ir vis tiek aerobinis.

Ji nepatvirtina kiekvienos kultivavimo sistemos dalies sąlygų. Viena juostelė neparodo ištirpusio deguonies sandariame mėgintuvėlyje, giliame agaro sluoksnyje įstrigusio deguonies, gradientų perpildytame inde ar nesandarumo, atsiradusio po rodmens įvertinimo. Erdviniai eksperimentai parodė gretimas mėlynas ir bespalves zonas tame pačiame inde, kur deguonies skverbimasis ir redukuojamasis aktyvumas buvo skirtingai subalansuoti. Vienas taškas negali patvirtinti viso tūrio sąlygų.

Ji neįrodo nepertraukiamos anaerobiozės. Juostelė, įvertinta tik vieną kartą ruošiant sistemą, nieko nepasako apie dvidešimtą valandą. Naujausi anaerobinių sąlygų kokybės tyrimai įspėja, kad cheminiai indikatoriai apibūdina atmosferą tuo momentu, kai vertinamas jų rodmuo, ir gali atrodyti tinkamai net esant mažam likutiniam deguonies kiekiui. Juostelės rodmenis su inkubavimo eiga susieja nuolatinis arba kontroliniais laiko momentais atliekamas dokumentavimas, o ne vienas žvilgsnis į galutinę būseną.

Daugiau apie spalvos pokytį lemiančią chemiją skaitykite straipsnyje kaip metileno mėlynasis cikliškai pereina iš oksiduotos būsenos į redukuotą ir atgal. Apie platesnį deguonies poveikį mėginių tvarkymui skaitykite medžiagoje apie deguonies kontrolę mikroskopijos ir kultivavimo darbuose.

Schema, kurią verta laikyti šalia indo

Toliau pateiktame paveiksle straipsnio esmė sutraukta į vieną laboratorijoje patogią atmintinę. Joje parodytos trys tos pačios juostelės būsenos, dvi reakcijos kryptys ir riba tarp indikatoriaus pateikiamų duomenų ir sistemos validavimo.

Gedimai, dėl kurių juostelė lieka mėlyna arba nepagrįstai nuramina

Dauguma gedimų patenka į penkias grupes. Kiekviena turi savitų požymių.

Nesandarus indas ar maišelis nuolat tiekia deguonį į reakcijos zoną. Juostelė lieka mėlyna arba išblukusi vėl pamėlynuoja. Prieš kaltindami chemiją, patikrinkite dangtį, tarpinę, spaustukus ir sandarinimo paviršius.

Išeikvotas arba netinkamai aktyvintas dujų generatorius deguonies nepašalina. Senesnėse vandeniu aktyvinamose sistemose kondensato nebuvimas maždaug po 10–15 minučių ir dangčio nešilimas maždaug po 20–40 minučių buvo ankstyvi tos sistemos sutrikimo požymiai. Per mažo pajėgumo paketėlis perpildytame inde neveikia dėl tos pačios priežasties.

Katalizatoriaus apnuodijimas aktualus tik senesnėms vandenilio ir paladžio sistemoms, kuriose paladis skatina vandenilio ir deguonies reakciją, susidarant vandeniui. Drėgmė ir vandenilio sulfidas mažina jo aktyvumą. Daugelyje dabartinių paketėlių paladis visai nenaudojamas, todėl netaikykite šio taisymo būdo ten, kur jis netinka.

Suprastėjusi arba netinkamai naudota juostelė gali sugesti nepastebimai. Laikant dažiklis ir reduktorius praranda gebėjimą grįžtamai keisti būseną. Tai viena priežasčių, kodėl buvo sukurtos hibridinės sudėtys, atsparios blukimui dėl šviesos ir savybių praradimui laikant. Nenaudokite pasibaigusio galiojimo atsargų, juostelių, kurių pradinė spalva neįprasta, taip pat juostelių, sudrėkintų, kai jos turėjo likti sausos, arba paliktų sausų, kai jas reikėjo sudrėkinti.

Gradientas arba reakcijos vėlavimas suklaidina rodmenį vertinantį žmogų, o ne cheminę sistemą. Prastai susimaišiusi dujinė erdvė, sandarūs mėgintuvėliai su ištirpusiu deguonimi ir pusiau kietos terpės išlaiko savo sąlygas ilgiau, nei leidžia manyti juostelė. Rezazurino juostelės pirmiausia tampa rožinės, paskui bespalvės ir dažnai pristatomos kaip greitesnės, tačiau jų slenkstinės vertės priklauso nuo konkrečios sudėties ir negali būti taikomos metileno mėlynajam.

Kontrolės ir rodmenų vertinimo protokolas, kurį verta perimti

Dvi nebrangios kontrolės padeda išvengti daugumos klaidingų vertinimų. Šalia bandymo laikykite naują kontrolinę juostelę patalpos ore. Veikianti metileno mėlynojo juostelė ten išlieka mėlyna. Kai kurie supakuoti indikatoriai iš pradžių būna blyškūs ir atidarius pakuotę pamėlynuoja; tai savaime yra veikimo patikra. Taip pat periodiškai įdėkite naują juostelę į anksčiau validuotą anaerobinę sistemą. Ji turėtų pasiekti validuotą galutinę redukuotą būseną per gaminio instrukcijoje nurodytą laiką. Jei kuri nors kontrolė veikia netinkamai, prieš pasitikėdami indo rodmenimis pakeiskite partiją.

Rodmenų vertinimo protokolas kyla iš veikimo mechanizmo. Padėkite juostelę dujinėje erdvėje taip, kad ji būtų matoma neatidarius indo, ir vadovaukitės gaminio instrukcija dėl sąlyčio su sienele bei drėkinimo. Užregistruokite pradinę spalvą, indo sandaraus uždarymo laiką ir spalvą gaminio instrukcijoje nurodytu kontroliniu momentu. Jei indas leidžia, nustatytais kontroliniais laiko momentais inkubavimo metu užregistruokite, kad indikatorius išliko redukuotas. Galutinę spalvą užregistruokite prieš pat atidarymą. Būtent ši spalva prieš atidarymą yra galutinis to bandymo rodmuo. Atidarius tikėkitės pakartotinio pamėlynavimo ir neleiskite jam pakeisti jau užfiksuotų rezultatų.

Jei juostelė lieka mėlyna ilgiau nei nurodytą laiką, anaerobiozę laikykite nepatvirtinta. Tikrinkite nuosekliai: sandarumą, paketėlį, katalizatorių, jei jis yra, indikatoriaus sudrėkinimą ir galiojimą, tada indikatoriaus veikimą, palygindami su kontroline juostele ore. Tik patvirtinus atmosferos sąlygas galima interpretuoti augimą arba jo nebuvimą, naudojant konkrečiai paskirčiai pritaikytas anaerobinio kultivavimo sistemos ir organizmų kontroles.

Juostelei priklauso galutinis žodis tik jos pačios srityje. Mėlyna ar bespalvė, ji atsako į vieną klausimą apie vieną vietą vienu laiko momentu. Užduokite jai tą klausimą pagal nustatytą grafiką, kartu naudodami kontroles, ir ji atsakys patikimai. Klauskite apie sterilumą, kiekvieną mėgintuvėlį ar visą inkubavimo eigą, remdamiesi vienu žvilgsniu, ir jokia indikatoriaus chemija neišgelbės tokio vertinimo.