Metileno mėlynasis ir šviesos poveikis: bangos ilgis, energinė apšvieta ir procedūros geometrija

Dviejuose straipsniuose nurodoma, kad metileno mėlynasis buvo apšvitintas 10 J vienam kvadratiniam cm šviesos doze. Vienu atveju bakterijos žūsta. Kitu atveju jokio išmatuojamo poveikio nėra. Skaitytojas, lyginantis tik dozę, daro išvadą, kad šios srities rezultatai prieštaringi. Tačiau srities rezultatai nuoseklūs. Dozė niekada neapibūdino visų apšvitinimo sąlygų.

Apšvitinimas šviesa yra nedidelė kartu veikiančių parametrų sistema: bangos ilgis, energinė apšvieta, trukmė, iš jų gaunama fluencija, deguonies prieinamumas, dažiklio koncentracija ir agregacijos būsena, intervalas tarp dažiklio skyrimo ir apšvitinimo bei optinis kelias, kurį šviesa iš tikrųjų nueina mėginyje. Pakeitus vieną iš jų, keičiasi fotochemija. Šiame straipsnyje aptariamas kiekvienas parametras, o tada atskiriama artimosios infraraudonosios šviesos fotobiomoduliacija nuo tiesioginės dažiklio fotoaktyvacijos, nes būtent šie du veikimo režimai painiojami dažniausiai.

Bangos ilgis lemia, ar dažiklis dalyvauja reakcijose

Vandenyje metileno mėlynasis monomero pavidalu stipriai sugeria raudoną šviesą: sugerties maksimumas yra maždaug ties 664–665 nm, o trumpesnių bangų pusėje, maždaug ties 610 nm, yra petys, kuris didėja dažikliui agreguojantis į dimerus ir didesnes molekulių sankaupas. Molinis ekstinkcijos koeficientas ties maksimumu yra maždaug 65,000–85,000 M-1 cm-1, todėl net mikromoliniai tirpalai jau yra intensyviai mėlyni. Ankstyvoje metileno mėlynojo fotocheminės sąveikos su DNR ir biologiniais substratais apžvalgoje aprašomas šis sugerties pobūdis ir po jos vykstanti sužadintųjų būsenų chemija: sugertis sukuria trumpaamžę singuletinę būseną, kuri pereina į ilgiau gyvuojančią tripletinę būseną; nurodoma šio perėjimo išeiga yra apie 0.5, o aeruotame tirpale deguonis tripletinę būseną užgesina per maždaug 2 mikrosekundes.

Būtent šiame gesinimo etape išsiskiria du fotocheminiai keliai. II tipo reakcijose tripletinės būsenos dažiklis perduoda energiją pagrindinės būsenos deguoniui ir sukuria singuletinį deguonį; dažnai nurodoma išeiga yra apie 0.52. I tipo reakcijose tripletinės būsenos dažiklis vietoj to perduoda elektroną arba vandenilį substratui, taip sudarydamas radikalus, įskaitant superoksido ir hidroksilo radikalus. Abu keliai gali veikti vienu metu, o įprastas fotodinaminis poveikis išlieka stipriai priklausomas nuo deguonies net ir prisidedant I tipo reakcijoms.

Iš to kyla paprasta metileno mėlynajam tinkamo bangos ilgio pasirinkimo taisyklė. Maždaug 630–680 nm raudona šviesa sutampa su dažiklio sugerties juosta, o 660–665 nm yra arti monomero sugerties maksimumo, todėl ji gali sukelti fotosensibilizatoriaus fotochemines reakcijas visur, kur yra reikšmingas dažiklio kiekis. 810 nm artimoji infraraudonoji šviesa yra gerokai už pagrindinės būsenos sugerties juostos ribų, todėl šis bangos ilgis netinka tiesioginiam dažiklio sužadinimui. Koncentracija šį vaizdą apsunkina vienu aiškiu aspektu: jai didėjant, vis daugiau dažiklio yra dimerų ir agregatų pavidalu, kurie sugeria arčiau 610 nm ir, skaičiuojant vienai molekulei, fotosensibilizuoja mažiau efektyviai, todėl padvigubinus dažiklio kiekį poveikis nepadvigubėja. Susijusioje metileno mėlynojo ir raudonos šviesos terapijos apžvalgoje ši sugerties taisyklė laikoma būtina bet kurios fotosensibilizuotos reakcijos sąlyga.

Energinė apšvieta, trukmė ir fluencija yra trys parametrai, o ne vienas

Fluencija, išreiškiama J vienam kvadratiniam cm, yra energinės apšvietos ir laiko sandauga. Nurodant vien fluenciją, neatskleidžiama, kokiu greičiu energija buvo perduodama, o šis greitis yra svarbus.

Trumpalaikė didelė energinė apšvieta ir ilgalaikė maža energinė apšvieta gali suteikti tą pačią fluenciją, tačiau sukelti skirtingas chemines reakcijas. Didelė energinė apšvieta sunaudoja ištirpusį deguonį greičiau, nei jis papildomas difuzijos būdu, todėl dar nesibaigus apšvitinimui sulėtėja nuo deguonies priklausantis II tipo reakcijų kelias. Ji taip pat perduoda šilumą, o audinys į kaitimą reaguoja kraujotakos pokyčiais, kurie keičia ir aprūpinimą deguonimi, ir dažiklio pasiskirstymą. Maža energinė apšvieta ilgai apšvitinant leidžia palaikyti deguonies tiekimą, tačiau kartu suteikia laiko atkūrimo ir pakartotinio aprūpinimo deguonimi procesams vykti dar apšvitinimo metu. Fotochemijos vadovėliuose prielaida, kad svarbi tik bendra dozė, vadinama abipusiškumo principu. Jis negalioja, kai reikšmės turi deguonis, kaitimas ar biologiniai procesai, o audiniuose taip būna beveik visada.

Žmonėms taikant antimikrobinį fotodinaminį apšvitinimą su metileno mėlynuoju, dažnai naudojama 6–18 J vienam kvadratiniam cm, o šis intervalas persidengia su fotobiomoduliacijos vertėmis. Todėl vien pagal fluenciją negalima nustatyti veikimo režimo. Audinio, kuriame yra dažiklio, apšvitinimas 660 nm šviesa, suteikiant 10 J vienam kvadratiniam cm, yra fotosensibilizatoriaus sukeliama fotochemija. Ta pati fluencija, kai audinys su pėdsakiniu dažiklio kiekiu apšvitinamas 810 nm šviesa, reiškia visai ką kita. Skaičius sutampa. Veikimo principas skiriasi.

Optinis kelias ir mėginio geometrija lemia, ką šviesa pasiekia

Pagal Bero–Lamberto dėsnį priekinę mėginio dalį pasiekia gerokai daugiau šviesos nei galinę. Kiuvetėje, kurioje dažiklio koncentracija siekia dešimtis mikromolių, pirmasis milimetras gali sugerti didžiąją dalį krintančios raudonos šviesos, todėl gilesni sluoksniai iš esmės lieka neapšvitinti. Tą patį tirpalą perkėlus į negilų šulinėlį ir sumažinus jo tūrį, apšvitinimas tampa beveik vienodas. Tas pats dažiklis, ta pati lempa, ta pati fluencija paviršiuje, bet kitoks rezultatas.

Audiniuose prie sugerties prisideda sklaida. Raudona šviesa ties 660 nm prasiskverbia maždaug kelis milimetrus, o tikslų gylį lemia kraujo kiekis, pigmentacija ir audinio tipas. Šulinėliai sukelia savų artefaktų: menisko lęšio efektą, atspindžius nuo sienelių, kraštinių šulinėlių užtemdymą ir mažų tūrių šilimą po šviesos šaltiniu. Dvi laboratorijos, nurodančios vienodus lempos nustatymus, bet naudojančios skirtingų tipų plokšteles, tūrius ar atstumus iki šaltinio, atliko skirtingus eksperimentus.

Atstumą verta pabrėžti, nes tai dažniausias nepastebimas kintamasis. Tolstant nuo nekolimuoto šaltinio, energinė apšvieta sparčiai mažėja, todėl pakėlus lempą nuo 2 cm iki 5 cm virš plokštelės, energinė apšvieta gali sumažėti kelis kartus, nors metodų skilties aprašymas lieka toks pats. Neišmatavus energinės apšvietos mėginio paviršiuje, paskelbtos fluencijos, apskaičiuotos pagal gamintojo nurodytą galią, yra įverčiai, o ne matavimai.

Parametrų vadovas su paaiškinimais: kas užtikrina apšvitinimo atkuriamumą

Šiam puslapiui sukurta originali vaizdinė medžiaga yra kontrolinis sąrašas. Tyrime taikyto apšvitinimo šviesa, kurio apraše trūksta šių duomenų, negalima palyginti su kitu, kad ir kaip panašiai atrodytų pagrindinė nurodyta dozė.

1. Bangos ilgis ir spektrinės juostos plotis. Maksimumas ir visas plotis, o ne spalvos pavadinimas. Raudoni LED apima 630–680 nm intervalą, kuriame dažiklio sugertis labai skiriasi.
2. Išmatuota energinė apšvieta mėginio paviršiuje, mW vienam kvadratiniam cm. Gamintojo nurodyta galia vatais nėra energinė apšvieta.
3. Trukmė ir impulsinis režimas. Nuolatinis ar impulsinis apšvitinimas, įskaitant impulsų dažnį ir darbo ciklą, kai taikoma.
4. Fluencija, apskaičiuota pagal pirmiau nurodytą išmatuotos energinės apšvietos ir trukmės porą, J vienam kvadratiniam cm.
5. Dažiklio koncentracija, sudėtis ir agregacijos būsena. Monomeras ties 664 nm fotosensibilizuoja kitaip nei agregatai ties 610 nm.
6. Intervalas tarp medžiagos skyrimo ir apšvitinimo. Minutės ar valandos nuo dažiklio skyrimo iki apšvitinimo lemia, kur dažiklis yra atėjus šviesai.
7. Aprūpinimas deguonimi. Aeruotas tirpalas ir hipoksinis audinys tiesiogiai keičia I ir II tipo reakcijų pusiausvyrą.
8. Geometrija. Mėginio gylis, tūris, indo tipas, atstumas iki šaltinio ir jo kampas bei tikslinio audinio gylis.

Naudingas įprotis skaitant straipsnius: pirmiausia patikrinkite intervalą tarp medžiagos skyrimo ir apšvitinimo. Jis atskleidžia sumanymą. Fotodinaminių tyrimų schemose audinys su dažikliu apšvitinamas sąmoningai. Derinių tyrimų schemose šie du veiksmai gali būti tyčia atskirti, kaip aprašyta toliau.

Artimosios infraraudonosios šviesos fotobiomoduliacija nėra dažiklio fotoaktyvacija

Fotobiomoduliacija, paprastai trumpinama PBM, naudoja raudoną arba artimąją infraraudonąją šviesą endogeniniams signaliniams procesams moduliuoti, nepridedant fotosensibilizatoriaus. Fotodinaminė terapija, paprastai trumpinama PDT, kartu naudoja tris komponentus: fotosensibilizatoriaus sugeriamą šviesą, patį fotosensibilizatorių ir deguonį, kad sukeltų staigų reaktyviųjų dalelių susidarymą, pažeidžiantį taikinį. Mitochondrijų, kaip neuroprotekcijos taikinio, apžvalgoje metileno mėlynasis siejamas su PBM, nes jie veikia kvėpavimo procesus skirtingais būdais: dažiklis veikia kaip katalizinis oksidacijos–redukcijos ciklų tarpininkas, palaikantis elektronų srautą, o PBM, kaip manoma, skatina slopinančio azoto monoksido atsiskyrimą nuo citochromo c oksidazės IV komplekse. Šis fermentinis mechanizmas ir toliau turėtų būti aiškiai įvardijamas kaip hipotezė.

Dviejuose dažniausiai cituojamuose derinio tyrimuose su pelėmis naudota 810 nm šviesa, ir būtent todėl jie neparodo dažiklio fotoaktyvacijos. Išankstinio poveikio prieš miego stoką tyrime pelėms prieš miego stoką kasdien buvo skiriama metileno mėlynojo po 0.5 mg vienam kg, kas antrą dieną taikomas 810 nm impulsinis lazeris arba abu poveikiai kartu. Bendras išankstinis poveikis apsaugojo su atmintimi susijusį elgesį ir hipokampo sinapsinius baltymus, o pavienės intervencijos iš esmės buvo neveiksmingos. Lėtinio streso tyrime, kuriame gydymo būdai buvo taikomi tuo pačiu laikotarpiu, pelėms taikyta 810 nm PBM, suteikiant 8 J vienam kvadratiniam cm, kartu kasdien skiriant dažiklio po 0.5 mg vienam kg; pirmiausia taikytas lazeris, o dažiklis sušvirkštas po dviejų valandų, būtent siekiant išvengti audinio su dažikliu apšvitinimo. Visose trijose grupėse mokymosi sutrikimai išnyko, o suminis poveikis daugiausia pasireiškė serumo kortizolio ir smegenų reaktyviųjų deguonies formų rodikliams. Šie rezultatai vertina dvi kartu taikomas mitochondrijų intervencijas; fotodinaminių tyrimų rinkinyje šis skirtumas aiškiai išlaikomas, registruojant bangos ilgį pagal kiekvieną indikaciją.

Odos tyrimų duomenys priklauso kitam veikimo režimui. Žmonių odos tyrimuose metileno mėlynojo ir šviesos derinio duomenys daugiausia susiję su 630–680 nm šviesa, vietiškai arba į pažeidimą skiriamu dažikliu ir siekiu suardyti arba remodeliuoti audinį, o tai pagal apibrėžimą yra PDT. Šio pažeidimų išnykimo pateikimas kaip įrodymo, kad dažiklis sustiprina PBM, arba 810 nm tyrime su pelėmis nustatyto atkūrimo pateikimas kaip įrodymo, kad 660 nm šviesos panelis kartu su dažikliu yra pažinimo funkcijų gerinimo protokolas, suplaka skirtingus veikimo režimus. Dozavimo ir farmakologijos žinyne bei saugos ir sąveikų vadove išsamiau aptariami šios temos aspektai, susiję su koncentracija ir kontraindikacijomis.

Prieš lygindami skaičius, įvardykite veikimo principą. Bangos ilgis lemia, ar dažiklis sugeria šviesą. Energinė apšvieta ir trukmė lemia, kokios cheminės reakcijos vyks po sugerties. Geometrija lemia, kuri mėginio dalis apskritai patirs šį poveikį. Du apšvitinimai, sutampantys pagal vieną parametrą, bet besiskiriantys pagal kitus, yra skirtingi eksperimentai, o jų laikymas lygiaverčiais yra klaida, nuo kurios šis vadovas ir skirtas apsaugoti. Iš to negalima išvesti jokio namų sąlygomis taikytino protokolo; su dažiklio sugertimi suderinamo bangos ilgio šviesa ir sistemiškai skirtas dažiklis įprastai moduliuojantį apšvitinimą paverčia fotosensibilizatoriaus sukeliama fotochemija, kuri turi būti taikoma klinikinių specialistų.