Metileno mėlynasis ir kepenų suriebėjimas: ką nustatė eksperimentiniai tyrimai

Kepenų suriebėjimas – vienas pavadinimas kelioms skirtingoms problemoms. Vienam žmogui jį sukelia ilgalaikis gausus alkoholio vartojimas. Kitam – maistinių medžiagų perteklius kartu su atsparumu insulinui ir didesniu riebalų patekimu į kepenis. Abiem atvejais mikroskopu gali būti matomas paprastas riebalų kaupimasis, tačiau pirminės priežastys skiriasi. Šis skirtumas lemia, ką gali įrodyti konkretus eksperimentas.

Literatūros apie metileno mėlynąjį ir kepenų suriebėjimą yra nedaug, o visi šį klausimą nagrinėjantys tyrimai yra ikiklinikiniai. Dažniausiai cituojami trys tyrimai su žiurkėmis ir pelėmis, ir jų rezultatai nėra vienodi. Viename šėrimo etanoliu tyrime buvo pakoreguotas redokso pokytis, tačiau riebalų kiekis kepenyse nepakito. Viename daug riebalų turinčios dietos tyrime riebalų kiekis kepenyse sumažėjo kartu su signalinių procesų pokyčiu. Viename tyrime su sveikais gyvūnais nustatyti priešingi lipidų peroksidacijos rezultatai kepenyse ir inkstuose. Vertinami kartu, jie parodo, kodėl būtina atskirti tris vertinamąsias baigtis: redokso pokytį, signalinių procesų aktyvaciją ir riebalų kaupimąsi audiniuose.

Trys vertinamosios baigtys, kurias lengva supainioti

Redokso rodiklis apibūdina elektronų apykaitą. NAD+ ir NADH santykis kepenyse rodo, ar ląstelės aplinka yra santykinai oksiduota, ar redukuota. Oksiduojant etanolį NAD+ virsta NADH, todėl ilgalaikis alkoholio vartojimas mažina šį santykį. Elektronus priimantis dažiklis gali jį vėl padidinti. Tai cheminis procesas, o ne įrodymas, kad sukauptų riebalų sumažėjo.

Signalinių procesų rodiklis apibūdina reguliavimą. SIRT1 yra nuo NAD+ priklausomas reguliacinis fermentas, modifikuojantis baltymus, susijusius su mitochondrijų funkcija ir lipidų apykaita. AMPK veikia kaip mažo energijos kiekio jutiklis: aktyvintas jis skatina energijos substratų oksidaciją ir slopina lipidų sintezę. Kai straipsnyje pranešama, kad metileno mėlynasis aktyvina SIRT1 kepenyse, kalbama apie reguliacijos pokytį. Tai dar nėra paciento gydymo rezultatas.

Histologinis arba biocheminis rodiklis apibūdina pačias kepenis. Įprasti pavyzdžiai – trigliceridų kiekis viename grame audinio, neutraliųjų riebalų dažymas „Oil Red O“, balioninės degeneracijos ir pažeidimo vertinimas dažant hematoksilinu bei eozinu ir ALT aktyvumas plazmoje. Tik ši trečioji rodiklių grupė atsako, ar tame eksperimente metileno mėlynasis sumažino kepenų steatozę.

Atskiriant šias rodiklių grupes išvengiama dažniausios klaidingos interpretacijos: palankus redokso ar signalinių procesų rezultatas nereiškia mažesnio kepenų suriebėjimo.

Etanolio modelis: redoksas pakoreguotas, riebalų kiekis nepakito

Aiškiausias neigiamas rezultatas gautas ilgalaikio šėrimo etanoliu tyrime su Wistar žiurkių patinais. Gyvūnai gavo etanolio su skystu pašaru; jo dalis buvo didinama iki 36 procentų visos energijos. Kontroliniai gyvūnai buvo šeriami atitinkamais pašaro kiekiais, o etanolio energiją pakeitė gliukozė. Viena etanolio grupė ir viena kontrolinė grupė nuo 5 iki 30 dienos taip pat gavo metileno mėlynojo: 130 mg vienam litrui pašaro, arba maždaug 42 mg vienam kg per dieną.

Redokso būklė buvo vertinama pagal įprastas metabolitų poras: laktato ir piruvato santykį citozolyje bei 3-hidroksibutirato ir acetoacetato santykį mitochondrijose. Pradiniu šėrimo didelėmis etanolio dozėmis laikotarpiu etanolio grupėse nustatyti dideli pokyčiai: NAD+ ir NADH santykis citozolyje sumažėjo maždaug 62 procentais, o mitochondrijose – maždaug 71 procentu; taip pat padidėjo glicerolio 3-fosfato kiekis. Metileno mėlynasis iš esmės panaikino šiuos pokyčius ir grąžino glicerolio 3-fosfato kiekį beveik iki kontrolinių verčių, nepakeisdamas etanolio suvartojimo, kūno svorio prieaugio ar etanolio koncentracijos serume.

Riebalų kiekis kepenyse rodė ką kita. 12 dieną, prieš ryškų riebalų kaupimąsi, trigliceridų kiekis grupėse nesiskyrė. 27 dieną etanolio grupėse trigliceridų kiekis smarkiai padidėjo nepriklausomai nuo metileno mėlynojo. 30 dieną etanoliu šertų gyvūnų bendras lipidų kiekis padidėjo maždaug 89 procentais, o trigliceridų – maždaug 196 procentais; dažiklis ir šį kartą tam įtakos neturėjo. Centrilobulinė riebalinė infiltracija atrodė vienodai tiek skiriant preparatą, tiek jo neskiriant. Autoriai padarė išvadą, kad šiame modelyje etanolio sukeltas redokso pokytis nėra pagrindinė kepenų suriebėjimo priežastis po ilgalaikio šėrimo. Čia svarbu suprasti, kiek gyvūnų ir ląstelių tyrimų rezultatai gali būti pritaikomi vertinant riziką žmonėms: mechanizmas gali būti tikras, tačiau vis tiek nelemti galutinio rezultato.

Šį tyrimą verta cituoti, kai kas nors teigia, kad bet kokia redokso korekcija būtinai pašalina riebalus iš kepenų. Šiame eksperimente taip nenutiko.

Metabolinis modelis: signalinių procesų pokyčiai ir mažiau riebalų pelių kepenyse

Kitokį vaizdą pateikia hepatocitų ir daug riebalų turinčia dieta šertų pelių tyrimas, kuriame pagrindinis dėmesys skirtas SIRT1 ir AMPK. HepG2 ląstelėse, AML-12 ląstelėse ir pirminiuose žiurkių hepatocituose metileno mėlynasis padidino NAD+ ir NADH santykį bei SIRT1 baltymo kiekį, sumažino reguliatoriaus PGC-1alpha acetilinimą, padidino mitochondrijų DNR kiekį ir deguonies suvartojimą, taip pat aktyvino AMPK, o toliau signaliniame kelyje padidėjo CPT-1 ir PPARalpha. Sumažinus SIRT1 raišką, AMPK aktyvacija išnyko, todėl šioje ląstelių sistemoje signalinė grandinė siejama su SIRT1. Dažiklis taip pat slopino LXR agonisto T0901317 ir palmitato poveikio sukeltus lipogeninius signalus, įskaitant SREBP-1c, FAS ir ACC indukciją.

Tyrimo su gyvūnais dalyje C57BL/6 pelių patinai 8 savaites buvo šeriami dieta, kurioje riebalai sudarė 60 procentų. Paskutines 4 savaites keturis kartus per savaitę jiems per burną buvo skiriama 3 arba 10 mg metileno mėlynojo vienam kg per dieną. Preparatą gavusių pelių kepenys silpniau dažėsi „Oil Red O“, jose buvo mažiau trigliceridų, histologiškai nustatyta mažiau balioninės ir riebalinės degeneracijos, o ALT plazmoje buvo mažesnis nei preparato negavusių, daug riebalų turinčia dieta šertų pelių. Tame pačiame straipsnyje aprašyti farmakokinetiniai tyrimai parodė maždaug 31–35 procentų biologinį prieinamumą vartojant per burną: medžiaga beveik visiškai absorbuota žarnyne, tačiau smarkiai metabolizuota. Didžiausias koncentracijos audinyje ir plazmoje santykis nustatytas kepenyse, todėl, vertinant pasiskirstymą, poveikis kepenims bent jau yra tikėtinas.

Tai tikras steatozės sumažėjimo signalas, tačiau jo reikšmė ribota. Tai trumpas eksperimentas su pelėmis: kiekvienoje grupėje buvo 9–10 gyvūnų, naudota viena dieta, dvi dozės ir preparatas skirtas keturias savaites. Jame vertinami metabolinės steatozės ir steatohepatito požymiai, o ne su alkoholiu susijusi liga; netiriama cirozė, fibrozės regresija ar jokios baigtys žmonėms. Interpretuojant tokius rezultatus, mitochondrijų ir redokso rodikliai padeda pagrįsti hipotezę, o ne nustatyti dozę ar vartojimo protokolą.

Sveikų audinių vaizdas: ta pati dozė, priešingi rezultatai skirtinguose organuose

Trečiasis tyrimas dažnai pasitelkiamas teiginiams apie kepenis, kurių jis nepagrindžia. 30 dienų eksperimente su sveikomis Wistar žiurkių patelėmis penki gyvūnai su geriamuoju vandeniu gavo 1 mM metileno mėlynojo, o penki sudarė kontrolinę grupę. Superoksido dismutazė, katalazė ir redukuotas glutationas nepakito nei kepenyse, nei inkstuose. Lipidų peroksidacija kepenyse šiek tiek padidėjo, o inkstuose sumažėjo. ALT ir kreatinino kiekis serume sumažėjo, tačiau šlapalo azoto kiekis kraujyje nepakito.

Sąžininga interpretacija – organams būdingas poveikis sveikiems gyvūnams, o ne ligos gydymas. Pagal vieną rodiklį tas pats poveikis kepenyse atrodė silpnai prooksidacinis, o inkstuose pagal tą patį rodiklį – silpnai apsauginis, nors įprasti antioksidacinės apsaugos rodikliai nepakito. Kadangi kiekvienoje grupėje buvo penki gyvūnai ir nebuvo ligos modelio, šis straipsnis perspėja nevadinti metileno mėlynojo universaliu kepenų antioksidantu. Jis taip pat parodo, kodėl kepenų fermentų pokyčiams būtinas aiškiai apibrėžtas ligos kontekstas, kad juos būtų galima laikyti pagerėjimu.

Trijų kepenų eksperimentų palyginimas

Lentelė aiškiai parodo pagrindinę mintį. Panašus mėlynas dažiklis, skirtinga biologija. Etanolio tyrimas atskiria sėkmingą redokso korekciją nuo nesumažėjusio riebalų kiekio. Dietos tyrime viename modelyje kartu nustatyti signalinių procesų pokyčiai ir riebalų kiekio sumažėjimas. Tyrimas su sveikais gyvūnais rodo, kad skirtinguose organuose redokso rodikliai gali kisti priešingomis kryptimis.

Kodėl iš to negalima daryti išvados apie gydymą

Nė viename iš šių tyrimų nedalyvavo žmonės, kuriems nustatytas kepenų suriebėjimas. Tyrimuose skyrėsi dozės, vartojimo būdai ir trukmė; vien paprastu perskaičiavimu jų negalima paversti žmogui tinkama vartojimo schema. Mažos grupės – ypač trys gyvūnai kiekvienu redokso vertinimo laiko tašku etanolio tyrime ir penki gyvūnai grupėje sveikų gyvūnų tyrime – palieka daug neapibrėžtumo. Taip pat skiriasi lytis, linija, dietos sudėtis ir preparato skyrimo pradžia pažeidimo atžvilgiu. Be to, abu ligos modeliai atspindi skirtingas pirmines priežastis, todėl teigiamas dietos tyrimo rezultatas negali panaikinti neigiamo etanolio tyrimo rezultato ar atvirkščiai.

Žmogui, kuriam diagnozuota kepenų liga, svarbiau pirmiausia susipažinti su atsargumo priemonėmis, o ne ieškoti gydymo galimybių. Metileno mėlynojo vartojimo atsargumo priemonių esant inkstų ir kepenų sutrikimams apžvalgoje paaiškinama, kodėl sutrikusi organų funkcija keičia saugumo klausimus net tada, kai tyrimo su gyvūnais rezultatai atrodo palankūs. Gydytojui pateikite diagnozę, naujausius laboratorinių tyrimų rezultatus, tikslų preparato pavadinimą ir vartojimo būdą bei visą vartojamų vaistų sąrašą. Paklauskite, kokie įrodymai pagrindžia to preparato vartojimą tuo tikslu žmogui, kurio organų funkcijos sutrikimas yra tokio laipsnio.

Esmė: viename etanolio modelyje metileno mėlynasis pakeitė kepenų redokso būklę, tačiau nesumažino sukauptų riebalų; viename metaboliniame pelių modelyje jis aktyvino SIRT1 ir AMPK bei sumažino riebalų kiekį; sveikoms žiurkėms nustatytas skirtingiems organams būdingas redokso poveikis. Tai tyrimų kryptys, o ne pripažintas kepenų suriebėjimo gydymas.