Metileno mėlynasis ir autofagija: AMPK, mTOR ir eksperimentai su neuronais

Įsivaizduokite, kad atliekate eksperimentą su ląstelėmis, įdedate metileno mėlynojo ir imunoblotogramoje matote tamsėjančią baltymo LC3-II juostą. Kyla pagunda paskelbti, kad junginys „skatina autofagiją“, ir tuo apsiriboti. Tokia išvada per ankstyva. Tamsesnė LC3-II juosta gali reikšti, kad ląstelė formuoja daugiau valymo pūslelių, arba kad pūslelės kaupiasi, nes pašalinimo etapas užstrigo. Šios dvi interpretacijos rodo priešingas kryptis, o literatūroje apie metileno mėlynojo poveikį neuronams yra abiejų rūšių duomenų. Šiame straipsnyje nuosekliai aptariama, kas iš tiesų buvo matuojama kiekvienu tyrimo metodu.

Makroautofagija, čia tiriama autofagijos forma, yra ląstelės didelės apimties medžiagų perdirbimo procesas. Membraninis maišelis, vadinamas fagoforu, apgaubia susidėvėjusius baltymus ir organeles, užsidaro sudarydamas autofagosomą, susilieja su lizosoma, o jo turinys suskaidomas ir išlaisvinamas pakartotiniam naudojimui. Neuronams šis nuolatinis procesas būtinas, nes jie nesidalija ir negali sumažinti pažeistų dalių koncentracijos dalijimosi metu. Kai perdirbimas stringa, atliekos kaupiasi. Kai jis vyksta, ląstelė streso sąlygomis atgauna statybines medžiagas.

Ką parodė vienas eksperimentas su hipokampo ląstelėmis

Pagrindiniame indukcijos tyrime buvo naudojamos HT22 pelių hipokampo ląstelės, kurios 24 valandas patyrė stresą dėl serumo pašalinimo. Tokiomis sąlygomis pašalinami augimo veiksniai ir trofiniai signalai, todėl sukeliama ir apoptozė, ir autofagija. Tyrėjai pranešė, kad metileno mėlynasis mažino ląstelių žūtį priklausomai nuo dozės ir kad šį apsauginį poveikį lydėjo makroautofagijos požymiai.

Žymenų pokyčiai buvo konkretūs. Difuzinis LC3B dažymasis persiskirstė į taškinius darinius aplink branduolį, pradedant maždaug nuo 20 nM metileno mėlynojo koncentracijos, o stipriausias LC3-I ir LC3-II atsakas buvo stebimas ties maždaug 1 μM. Tiek LC3B-I, tiek LC3B-II kiekis didėjo priklausomai nuo dozės ir laiko. Svarbu tai, kad komanda neapsiribojo statine LC3 imunoblotograma. Tyrėjai pridėjo 10 μM chlorokvino, kuris blokuoja lizosominį pašalinimą, ir metileno mėlynuoju paveiktose ląstelėse nustatė didesnį LC3-II kiekį bei stabilizuotą p62. Toks derinys rodo nuo lizosomų priklausančią apykaitą, o ne vien kaupimąsi. Jie taip pat parodė, kad chlorokvinas iš dalies panaikino antiapoptozinį poveikį, todėl šiame modelyje apsauga siejama su autofagijos ir lizosomų keliu.

Signalizacijos rezultatas dažniausiai perteikiamas netiksliai. AMPK signalizacija, vertinta pagal fosforilintą AMPK ir jo tolesnį taikinį – fosforilintą ACC, sustiprėjo po 12 ir 24 valandų priklausomai nuo dozės. AMPK inhibitorius Compound C, naudotas 20 μM koncentracija paskutines 4 valandas, sumažino ir ACC fosforilinimą, ir LC3 aktyvinimą. Tačiau aptinkamo fosforilinto mTOR slopinimo nebuvo. Taigi streso veikiamose hipokampo ląstelėse nustatyta su AMPK susijusi indukcija, vykstanti, regis, nuo mTOR nepriklausomu keliu. Toks pat pobūdis stebėtas ir gyvose pelėse: metileno mėlynasis sukėlė makroautofagijos žymenų pokyčius žievėje ir hipokampe.

Indukcija nėra užbaigtas srautas

Čia svarbiausia atskirti sąvokas. Indukcija reiškia, kad ankstesnių etapų mechanizmai suformuoja daugiau autofagosomų. Srautas reiškia, kad skaidomas turinys pereina visą kelią: izoliavimą, brendimą, susiliejimą su lizosoma, skaidymą ir perdirbimą. Kiekvienas LC3-II padidėjimas yra tik pagrindas teigti indukciją, kol srauto tyrimas nepatvirtina likusios šio kelio dalies.

Standartiniu srauto tyrimu matuojamas LC3-II kiekis trumpam užblokavus lizosomas, pavyzdžiui, bafilomicinu A1 arba chlorokvinu, ir be tokios blokados. Jei poveikis iš tiesų spartina susidarymą, užblokavus skaidymą LC3-II kiekis turėtų dar labiau padidėti. Dvigubas mCherry-GFP-LC3 reporteris suteikia kitą vertinimo perspektyvą: prieš susiliejimą su lizosoma struktūros švyti geltonai, o rūgščiai nuslopinus GFP signalą – tik raudonai. Taigi daugiau vien raudonai švytinčių taškinių darinių rodo perėjimą į rūgščias autolizosomas. Mažėjantis p62 baltymo kiekis gali papildomai patvirtinti skaidomo turinio apykaitą, tačiau reikia atsižvelgti į tai, kad pati p62 transkripcija reaguoja į stresą ir turėtų būti tikrinama iRNR lygmeniu.

Toliau pateiktoje kontrolinėje lentelėje kiekvienas šioje literatūroje naudojamas tyrimo metodas susietas su tuo, ką jis matuoja ir ko vienas pats negali įrodyti. Skaitytojai gali ją taikyti vertindami bet kokius būsimus teiginius apie makroautofagiją, įskaitant argumentus apie badavimą ir ilgaamžiškumą, kurie remiasi šiais žymenimis.

Atkreipkite dėmesį į vieną formuluotės spąstą, nuo kurio saugo ši lentelė. Fosforilintas ACC yra fermentiškai slopinama forma. Jo padidėjimas rodo AMPK poveikį, o ne ACC aktyvinimą.

Teiginys „makroautofagijos slopinimas panaikino neuroprotekciją“ reikalauja tokio pat tikslumo. HT22 modelyje jis reiškia, kad sutrikdžius autofagijos ir lizosomų kelią išnyko metileno mėlynojo suteiktas išgyvenamumo pranašumas serumo stokos sąlygomis. Tai patvirtina, kad tame ląstelių kultūros modelyje autofagija yra būtina arba prisideda prie poveikio. Tai nenustato, kad autofagija yra vienintelis apsauginis junginio mechanizmas, neįrodo, kad chlorokvinas veikia tik per autofagiją, o priežastiniam teiginiui sustiprinti reikėtų genetinio ATG5, ATG7 arba ULK1 funkcijos sutrikdymo.

Du keliai į tą pačią sistemą

Padeda supaprastinta schema. Energetinis stresas didina AMPK aktyvumą, AMPK aktyvina ULK1 kompleksą ir prasideda autofagija. Augimo veiksniai ir maistinės medžiagos didina mTORC1 aktyvumą, mTORC1 slopina ULK1, todėl autofagija lieka neaktyvi. Toliau, po ULK1, Beclin-1 ir VPS34 kompleksas inicijuoja fagoforo formavimąsi, LC3-I lipidacijos metu virsta LC3-II, autofagosoma užsidaro, susilieja su lizosoma, o jos turinys suskaidomas kartu vykstant p62 apykaitai.

Schemoje kiekvienas metileno mėlynojo tyrimų rezultatas pateiktas atitinkamoje šio kelio vietoje: hipokampo ląstelių rezultatas – prie AMPK šakos, pirmtakinių ląstelių rezultatas – prie mTOR šakos.

Toks aiškinimas išsprendžia tariamą neatitikimą su antruoju Xie tyrimu. Atskirame eksperimente su proliferuojančiomis žiurkių nervų sistemos pirmtakinėmis ląstelėmis nustatyta, kad 5 μM metileno mėlynojo slopino proliferaciją ir skatino ramybės būseną: 1 ir 3 dienomis sumažėjo Ki67 teigiamų ląstelių, o jau neuronų kryptimi vykstanti diferenciacija išliko nepakitusi. Šiuo atveju mechanizmas veikė per nuslopintą mTOR signalizaciją: sumažėjo bendras mTOR ir fosforilinto mTOR kiekis, p70S6K ir 4EBP1 raiška bei ciklinų E1, B1, D1 ir D2 raiška. Vyraujantis fenotipas buvo pirmtakinių ląstelių ramybės būsena, kurią autoriai siejo su uždelstu ląsteliniu senėjimu, o ne su streso veikiamų hipokampo ląstelių apsauga.

Šie du straipsniai vienas kitam neprieštarauja. AMPK ir mTOR yra nuo konteksto priklausomi signalų integratoriai, o ne nekintami jungikliai. Streso veikiama į neuroną panaši ląstelė gali aktyvinti AMPK be išmatuojamo mTOR slopinimo, o mitogenų skatinama pirmtakinė ląstelė į tą patį junginį gali reaguoti slopindama nuo mTOR priklausančią augimo sistemą. Ląstelės tipas, streso kontekstas, koncentracija ir matavimo laikas lemia, kuri šaka vyrauja. Dėl to į tą patį vaizdą reikia įtraukti ir metileno mėlynojo poveikį mitochondrijų energetikai bei oksidacijos ir redukcijos procesams: kaip aprašoma neuroprotekcijos mechanizmų apžvalgoje, junginys veikia kaip alternatyvus elektronų pernešėjas, įtraukia antioksidacinę ir antiapoptozinę signalizaciją, slopina MAO ir NOS bei yra susijęs su mitochondrijų atsinaujinimu per biogenezę ir autofagiją. Autofagija yra viena daugialypio poveikio šaka, o ne visas jo paaiškinimas.

Ko eksperimentai neparodo

Serumo pašalinimas ląstelių kultūroje modeliuoja trofinį ir metabolinį stresą. Jis nemodeliuoja viso organizmo badavimo: bazinėje terpėje lieka gliukozės, aminorūgščių ir druskų, o jokio maitinimosi elgesio nėra. Kultūroje naudojamų koncentracijų nuo 20 nM iki 5 μM negalima aritmetiškai paversti dozėmis žmonėms, nes skiriasi absorbcija, prisijungimas prie baltymų, oksidacijos ir redukcijos būsena, metabolizmas, kaupimasis audiniuose ir poveikio trukmė.

Nė vienas tyrimas su žmonėmis nebuvo sukurtas siekiant parodyti metileno mėlynojo sukeltą autofaginį srautą pacientams. Mechanizmų įrodymai tebėra pagrįsti ląstelių, ex vivo ir gyvūnų tyrimais, o apžvalgose pritaikymo žmonėms įrodymai vis dar apibūdinami kaip preliminarūs. Taigi šie tyrimai neparodo, kad metileno mėlynasis atkuria badavimo poveikį, ilgina žmogaus gyvenimą per autofagiją arba užbaigia autofaginį srautą žmogaus smegenyse. Teiginiams apie badavimą imituojantį poveikį ir ilgaamžiškumą reikia atskirų klinikinių įrodymų, o metileno mėlynojo tyrimai su žmonėmis dėl kitų indikacijų netampa autofagijos tyrimais vien dėl sąsajos. Maistinių medžiagų stokos sukelto streso ir ilgaamžiškumo modelių tyrimus reikėtų skaityti nepamirštant šios ribos.

Skaitydami kitą straipsnį, kontrolinį sąrašą taikykite iš eilės. Pirmiausia paklauskite, kuri šaka pasikeitė: AMPK, mTOR ar nė viena. Tada paklauskite, ar LC3 rezultatas buvo papildytas srauto tyrimu, ar pateiktas atskirai. Tuomet patikrinkite, ar užblokavus kelią išnyko naudingas poveikis ir kokiu metodu jis buvo blokuotas. Tyrimas, atsakantis į visus tris klausimus, pagrindžia tvirtą teiginį apie mechanizmą. Atsakantis tik į pirmąjį parodo leidžiamąjį signalą, o likusi kelio dalis lieka neištirta.