Metileno mėlynasis ir pagalbinės smegenų ląstelės: astrocitai, mikroglija ir uždegimas

Tarkime, atliekate du eksperimentus su tuo pačiu mėlynuoju dažikliu ir gaunate du vilčių teikiančius rezultatus. Viename inde žvaigždiškos pagalbinės ląstelės išgyvena deguonies ir gliukozės trūkumą. Kitame smegenų imuninės ląstelės, nepaisant bakterinio toksino poveikio, išlaiko ramybės būsenai būdingą šakotą formą. Kyla pagunda abu rezultatus sujungti į vieną teiginį: dažiklis slopina smegenų uždegimą ir apsaugo smegenis. Būtent ties šiuo sujungimu atidus skaitytojas turėtų stabtelėti.

Smegenyse yra dvi pagalbinių ląstelių populiacijos, atliekančios skirtingas užduotis, o metileno mėlynasis su kiekviena jų tiriamas pasitelkiant skirtingą eksperimentinį dirgiklį. Astrocitai yra metabolinę paramą teikiančios ląstelės. Jie išsidėstę tarp kraujagyslių ir neuronų, pašalina glutamato perteklių, padeda palaikyti kalio koncentraciją, kaupia glikogeną ir, padidėjus poreikiui, perduoda neuronams energijos substratus. Mikroglijos ląstelės yra smegenyse nuolat esančios imuninės stebėtojos. Jų plonos ataugos stebi audinį, aptinka bakterijų ir pažeidimo signalus, o gavusios pavojaus signalą susitraukia į apvalią ameboidinę formą, pritaikytą judėti ir įtraukti medžiagas į ląstelę, kartu išskirdamos signalines molekules. Vienoje populiacijoje gautas rezultatas negali būti taikomas kitai, o kiekvienu atveju naudojamas matavimas lemia, kas iš tiesų buvo parodyta.

Astrocitai metabolinio streso sąlygomis: rezultatas priklauso nuo laiko

Eksperimentas su astrocitais prasideda nuo deguonies ir gliukozės trūkumo. Tyrėjai augino naujagimių pelių smegenų žievės astrocitus, šešioms valandoms pašalino gliukozę ir beveik visą deguonį, o tada dvidešimt keturioms valandoms atkūrė abiejų tiekimą. Tai laboratorinis insulto ir po jo vykstančios reperfuzijos modelis. Kai metileno mėlynojo buvo trūkumo fazėje, ląstelių išgyvenamumas pablogėjo. Kai jo buvo pridėta tik atkūrus deguonies tiekimą, esant 0.1 ir 1 mikromolinei koncentracijai, išgyvenamumas reikšmingai pagerėjo, vertinant kalceino gyvybingumo tyrimu. Pelių astrocitų tyrime šis nuo laiko priklausantis skirtumas aprašomas kartu su kvėpavimo duomenimis.

Šis skirtumas yra svarbiausias rezultatas. Trūkumo fazėje beveik nėra deguonies, kuris galėtų priimti elektronus, todėl elektronų pernaša neturi kur jų perduoti. Atkūrus deguonies tiekimą, mechanizmai vėl pradeda veikti ir dažiklis turi ką atlikti. Metileno mėlynuoju paveikti astrocitai suvartojo daugiau deguonies, pasisavino daugiau gliukozės, pagamino daugiau ATP ir atkūrė glikogeno atsargas; heksokinazės aktyvumas buvo didesnis, o mitochondrijų superoksido kiekis nepadidėjo. Siūlomas paaiškinimas yra tas pats, kuris pateikiamas apžvalgoje apie metileno mėlynąjį kaip mitochondrijų elektronų nešiklį: jis perneša elektronus aplenkdamas užblokuotas kvėpavimo grandinės vietas, todėl kvėpavimas atsinaujina sklandžiai, užuot elektronams nutekėjus ir susidarius reaktyviosioms formoms.

Atkreipkite dėmesį, kokio pobūdžio tai įrodymai. Tai vieno izoliuoto ląstelių tipo išgyvenamumo ir metabolizmo rezultatas, gautas nustatytu veiksmingu laikotarpiu — atsikūrimo, o ne trūkumo fazėje — ir esant nustatytam koncentracijų intervalui. Jis nieko nepasako apie imuninių signalų perdavimą ir nieko nepasako apie elgesį.

Mikroglija gavus bakterinį pavojaus signalą: perprogramuotas metabolizmas

Eksperimentai su mikroglija prasideda nuo priešingo dirgiklio: ne badavimo, o tariamos infekcijos. Lipopolisacharidas, bakterijų išorinės membranos fragmentas, jungiasi prie įgimto imuniteto jutiklių ir paskatina mikrogliją reaguoti taip, tarsi būtų atsiradę patogenų, nors gyvų bakterijų nėra. Pelėms, kurioms buvo duota lipopolisacharido, ir kultivuojamoje mikroglijos ląstelių linijoje pasireiškia įprasta uždegiminė programa: daugėja uždegimą skatinančių veiksnių, mikroglija poliarizuojasi į agresyvią M1 būseną, žūsta gretimi neuronai, o gyvūnai prasčiau atlieka mokymosi ir atminties užduotis.

Šio atsako tyrime su pelėmis jis susiejamas su deguonies jutimo keliu: lipopolisacharidas per aukščiau esančią Siah2/Morg1 grandinę skatina perteklinę PHD3, vieno iš trijų prolilhidroksilazės fermentų, raišką. Tuo pat metu ląstelės perprogramuoja savo energijos apykaitą į aerobinę glikolizę, o mitochondrijų reaktyviųjų deguonies formų kiekis padidėja. Šį pokytį autoriai tiesiogiai įvertino „Seahorse“ metaboliniais tyrimais, matuodami deguonies suvartojimą ir tarpląstelinės terpės rūgštėjimą. Metileno mėlynasis panaikino ir metabolinį poslinkį, ir perteklinę PHD3 raišką, sumažino uždegiminių veiksnių kiekį, neuronų žūtį ir pagerino elgesio vertinimo rezultatus. Pozitronų emisijos tomografija papildė duomenis vaizdiniais tyrimais: lipopolisacharidas padidino hipokampo gliukozės pasisavinimą, matomą FDG-PET tyrime, o poveikis metileno mėlynuoju jį vėl sumažino. Tai dera su mažiau aktyviu uždegiminiu metabolizmu gyvose smegenyse.

Tai platesnis matavimų rinkinys nei astrocitų tyrime — citokinai, metabolizmas, vaizdiniai tyrimai ir gyvūnų elgesys, — tačiau jis susijęs su kitu dirgikliu ir kita ląstele. Lygindami šiuos du tyrimus, skaitytojai turėtų atskirti dirgiklius: viename tyrime badaujančios pagalbinės ląstelės išsaugomos atsikūrimo fazėje, kitame slopinamas tariamos infekcijos pavojaus signalas imuninėse ląstelėse.

Mikroglija po mikroskopu: forma kaip rodiklis

Trečiame eksperimente tas pats bakterinis pavojaus signalas vertinamas vien pagal formą. Žiurkių smegenų žievės glijos kultūrose kontrolinės mikroglijos ląstelės, nudažytos pagal IBA1 žymenį, turi daug plonų ataugų — tai šakota stebėjimo būsenai būdinga forma. Po dvidešimt keturių valandų lipopolisacharido poveikio, esant 10 mikrogramų mililitre koncentracijai, ląstelės suplokštėja ir įgauna ameboidinę formą. Jų kūno plotas padidėja, o perimetras išlieka apytikriai pastovus — tai geometrinis suapvalėjimo požymis. Metileno mėlynasis, pridėtas kartu su toksinu esant 1 mikromolinei koncentracijai, išsaugojo šakotas ataugas ir išlaikė kūno plotą bei perimetrą artimus kontrolinėms vertėms. Žiurkių ląstelių kultūros tyrime šis formos išsaugojimas kiekybiškai įvertinamas matuojant ląstelės kūno plotą ir perimetrą.

Dvi detalės suteikia šiam tyrimui daugiau vertės nei paprastam vaizdui. Pirma, palyginimui naudotas menadionas, kita redokso reakcijose aktyvi molekulė, esant tokiai pačiai koncentracijai formos neišsaugojo, o pats savaime skatino ląsteles įgauti aktyvuotą formą. Vadinasi, šis poveikis nėra bendra visų redokso cikluose dalyvaujančių medžiagų savybė. Antra, autoriai dažiklio poveikį sieja su Nrf2 aktyvinimu — transkripcijos veiksnio valdoma programa, reguliuojančia antioksidacinius ir uždegimą slopinančius genus, — o ne vien su tiesioginiu reaktyviųjų formų neutralizavimu. Susijusi redokso ir uždegiminių signalų perdavimo apžvalga suteikia šiai Nrf2 sąsajai kontekstą.

Vis dėlto forma yra mažiausiai informatyvus iš trijų rodiklių. Šakota ląstelė paprastai stebi aplinką, o apvali paprastai būna aktyvuota, tačiau morfologija yra pakaitinis rodiklis, o ne transkriptas. Šioje kultūroje nebuvo nei iš kraujo atkeliavusių imuninių ląstelių, nei neuroninių grandinių, nei elgesio rodiklių.

Trijų rezultatų palyginimas

Visose eilutėse matyti tas pats principas: kiekvienam dirgikliui tenka savas matavimas ir savas atsakymas. Metabolizmo atkūrimas atsako į klausimą apie metabolizmą. Citokinų ir elgesio duomenys atsako į klausimą apie uždegimą. Forma atsako į klausimą apie formą. Nė vienas iš šių trijų rezultatų savaime neleidžia daryti išvadų apie kitus.

Ko neįrodo ramesnė mikroglijos išvaizda

Visai šiai temai būtinas toks sakinys: mažiau aktyvuota atrodanti mikroglija ar pakitęs jos metabolizmas savaime neįrodo pagerėjusios smegenų funkcijos.

Morfologija gali pasikeisti, o funkcija — ne. Ląstelė gali išlaikyti ataugas ir vis tiek išskirti citokinus arba suapvalėti naudingai šalindama ląstelių liekanas. Metaboliniai rodikliai turi tą pačią ribą: „Seahorse“ kreivė ar PET vaizdas rodo energijos apykaitą, o ne pažinimo funkcijas. Tyrimas su pelėmis, kuriame metaboliniai ir su forma susiję rodikliai buvo derinami su elgesio testais, yra stipresnis būtent todėl, kad sujungė kelis įrodymų lygmenis, užuot visą išvadą grindęs vienu matavimu. Net ir jam galioja įprasti ribotumai: lipopolisacharidas modeliuoja sterilų pavojaus signalą, o ne tikrą infekciją, pelės nėra žmonės, o patys autoriai atkreipia dėmesį į rūšių skirtumus. Planuojant tolesnius darbus reikėtų įvertinti, kiek mikroglijos tyrimų rezultatai perkeliami iš vieno modelio į kitą, prieš darant prielaidą, kad šis kelias žmogaus audinyje veikia taip pat.

Iš to kyla praktinė išvada apie poveikio laiką. Astrocitų tyrime ankstyvas medžiagos skyrimas pablogino rezultatą, o skyrimas atsikūrimo fazėje jį pagerino. Mikroglijos rezultatai gauti medžiagą skiriant maždaug tuo metu, kai veikė uždegiminis dirgiklis. Tikras smegenų pažeidimas vienu metu apima abi fazes: energijos apykaitos sutrikimą ir imuninį pavojaus signalą, kurie kinta per kelias valandas. Eksperimentas, izoliuojantis vieną fazę, negali nustatyti skyrimo laiko šiam bendram atvejui, todėl aptariant skyrimo laikotarpius deguonies ir gliukozės trūkumo bei uždegimo eiga nagrinėjama atskirai.

Tiksli santrauka telpa į vieną pastraipą. Izoliuotuose astrocituose metileno mėlynasis, pridėtas atkūrus deguonies tiekimą, atnaujina kvėpavimą ir išsaugo ląsteles. Mikroglijoje, paveiktoje bakteriniu fragmentu, jis per konkretų PHD3 kelią panaikina uždegiminę metabolinę programą ir išsaugo ramybės būsenai būdingą formą. Kiekvienas rezultatas yra tikras savo eksperimento sąlygomis, tačiau nė vienas nėra bendras verdiktas apie smegenų uždegimą. Glijos ląstelių palyginimas naudingas būtent todėl, kad neleidžia šiems dviem pasakojimams susilieti į vieną.