Metileno mėlynas ir neurotransmiteriai: serotoninas, dopaminas, GABA ir acetilcholinas

Dažnai apie metileno mėlyną sakoma, kad jis vienu metu didina serotonino ir dopamino kiekį, ramina per GABA ir stiprina acetilcholino veikimą. Toks teiginys keturis atskirus laboratorinių tyrimų rezultatus pateikia kaip vieną poveikį žmogaus organizme. Jį pagrindžiančiuose straipsniuose buvo matuojami skirtingi taikiniai, naudojant skirtingus eksperimentinius preparatus ir koncentracijas, kurios skiriasi maždaug tūkstantį kartų. Atskyrus taikinius, vaizdas tampa ir įdomesnis, ir reikalaujantis daugiau atsargumo, nei leidžia tas vienas sakinys.

Pagrindinė mintis paprasta. Molekulė, kuri mėgintuvėlyje prisijungia prie fermento, padarė vieną dalyką: mėgintuvėlyje prisijungė prie fermento. Ar tai pakeičia neurotransmiterio kiekį gyvose smegenyse, priklauso nuo audinį pasiekiančios koncentracijos, nuo molekulės cheminės formos jai pasiekus audinį ir nuo visų kitų tos molekulės poveikių esant tai pačiai koncentracijai. Kiekviename tolesniame skyriuje šie trys klausimai aptariami kartu su atitinkamu tyrimo rezultatu.

Serotoninas: du taikiniai, dvi koncentracijos

Iš keturių sistemų serotonino atveju įrodymai stipriausi. Jie susiję su dviem skirtingais molekuliniais taikiniais, kurių nereikėtų suplakti į vieną.

Pirmasis taikinys yra A tipo monoaminooksidazė — mitochondrijų fermentas, skaidantis serotoniną. Metileno mėlynas slopina išgrynintą žmogaus MAO-A kaip stipriai prisijungiantis inhibitorius, kurio Ki yra apie 27 nanomolius litrui, o poveikiui MAO-B reikia gerokai didesnių koncentracijų, kaip parodyta kinetiniame tyrime, susiejusiame dažiklį su serotonino toksiškumu. Susijusiuose tyrimuose toks pat selektyvumas nustatytas žiurkių kankorėžinės liaukos audinyje: MAO-A blokada padidino iš serotonino susidarančių indolų kiekį, sumažino serotonino metabolito 5-HIAA kiekį ir pakeitė su serotoninu susijusį varlių atsivertimo refleksą. Tai aprašyta redokso dažiklių ir kankorėžinės liaukos indolų tyrime. Du skirtingi eksperimentiniai preparatai, ta pati kryptis: mažiau skaidymo ir daugiau išlikusio serotonino ten, kur fermentas būtų jį suskaidęs.

Antrasis taikinys yra pats serotonino pernešiklis. Ląstelėse, ekspresuojančiose žmogaus pernešiklį, metileno mėlynas sumažino tiek fluorescencinio substrato, tiek žymėto serotonino įsiurbimą; IC50 buvo apie 1.4 mikromolio litrui. Jis taip pat slopino serotonino sukeltas sroves, registruotas membranos lopinėlio fiksavimo metodu, kaip aprašyta tiesioginiame metileno mėlyno poveikio SERT tyrime. Autoriai patikrino akivaizdžius alternatyvius paaiškinimus ir nustatė, kad poveikis nepriklausė nuo cGMP signalizacijos, kalcio pokyčių ir pernešiklio ekspresijos ląstelės paviršiuje.

Atkreipkite dėmesį į skirtumą tarp šių dviejų skaičių. MAO-A slopinimas vyksta esant nanomolinėms koncentracijoms. Pernešikliui slopinti reikia maždaug penkiasdešimt kartų daugiau dažiklio. Nedidelė ekspozicija, kurios pakanka fermentui visiškai paveikti, pernešiklį gali veikti vos pastebimai. Sujungus šiuos rezultatus į vieną teiginį apie serotoniną, du skirtingi dozių intervalai suvedami į vieną.

Ar kuris nors iš šių taikinių svarbus žmogui, vartojančiam kitus serotoninerginius vaistus, yra vaistų vartojimo klausimas, aptariamas vaistų sąveikų vadove. Šiame straipsnyje apžvelgiami taikiniai; klinikinės rekomendacijos pateikiamos tame puslapyje.

Dopaminas: silpniausi tiesioginiai įrodymai

Kalbant apie dopaminą, sąžiningumas reikalauja didžiausio santūrumo. Nėra patikimai pagrįsto tyrimo, rodančio, kad metileno mėlynas blokuoja dopamino pernešiklį arba tiesiogiai jungiasi prie dopamino receptorių. Dažnai cituojama 1.4 mikromolio litrui pernešiklio IC50 reikšmė taikoma serotonino pernešikliui, o ne DAT, ir jos niekada nederėtų priskirti kitam taikiniui.

Turimi duomenys yra netiesioginiai. Kadangi MAO fermentai taip pat metabolizuoja dopaminą, MAO slopinimas padeda išsaugoti dopaminą kartu su serotoninu ir noradrenalinu. Mitochondrijų preparatuose metileno mėlynas blokavo MAO-B vykdomą neurotoksino MPTP virtimą dopaminerginei sistemai toksiška medžiaga, o jo slopinimo stiprumas buvo panašus į Parkinsono ligai gydyti vartojamo deprenilio, kaip aprašyta MPTP bioaktyvinimo tyrime ir susijusiuose MAO-B tyrimuose. Tyrimai su gyvūnais papildo vaizdą atskirais fragmentais: esant 10 mikromolių litrui koncentracijai, bazinis dopamino išsiskyrimas iš žiurkių dryžuotojo kūno pjūvių padidėjo maždaug tris kartus. Tai tirta azoto monoksido signalizacijos, o ne pernešiklio blokados kontekste. Sistemiškai pavartojus medžiagą, rezultatai skirtingose srityse buvo nevienodi: kai kuriuose tyrimuose serotonino ir noradrenalino kiekis didėjo, o dopamino beveik nekito.

Taigi dopamino istorija turi pagrindą, tačiau jis netiesioginis. Ji susijusi su fermentu, kuris vienu metu veikia kelis monoaminus, o ne su dopaminui specifiniu taikiniu. Bet kuris teiginys, kad metileno mėlynas didina dopamino kiekį žmonėms, praleidžia etapą, kuriame tai turėtų būti iš tikrųjų parodyta.

GABA: slopinančio signalo blokavimas prisijungimo kišenėje

GABA tyrimo rezultatas yra tikslus ir prieštarauja įprastam dažiklio įvaizdžiui. Ląstelėse, ekspresuojančiose žmogaus GABA-A receptorius, metileno mėlynas slopino GABA sukeltas sroves jau nuo maždaug 3 mikromolių litrui koncentracijos. Įprastos alpha1-beta2-gamma2 konfigūracijos IC50 buvo apie 31 mikromolį litrui, kaip nustatyta elektrofiziologiniame tyrime, kuriame nustatyta veikimo vieta.

Vertingiausia šio tyrimo dalis — veikimo vietos nustatymas. Mutacijos pikrotoksino prisijungimo vietoje slopinimo nepakeitė, o benzodiazepinų ir cinko prisijungimo vietų dalyvavimas buvo atmestas palyginus subvienetus. Tačiau dviejų aminorūgščių liekanų, kurios, kaip žinoma, sudaro pačią GABA prisijungimo kišenę, mutacijos smarkiai susilpnino blokadą. Tai rodo konkurencinį antagonizmą agonisto prisijungimo vietoje, o ne alosterinį moduliavimą kitoje vietoje. Poveikis pasireiškė tiek sinapsinių, tiek ekstrasinapsinių subvienetų deriniuose ir greitai išnyko išplovus medžiagą.

Tai sukuria tikrą prieštarą, kurią verta įvardyti aiškiai. Molekulė, tiriama dėl galimo atminties palaikymo, kartu slopina greitąjį slopinamąjį signalų perdavimą laboratoriniame preparate. Ar toks slopinimas vyksta gyvose smegenyse, priklauso nuo vietinės koncentracijos, o 31 mikromolis litrui yra didelė koncentracija, palyginti su dauguma sisteminės ekspozicijos lygių, aptariamų paskutiniame skyriuje. Pati ši prieštara yra tyrimo rezultatas; jai išspręsti reikėtų eksperimentų, kurių niekas neatliko.

Acetilcholinas: du priešingai veikiantys taikiniai

Acetilcholino atveju yra du priešingomis kryptimis rodantys rezultatai, todėl juos ir būtina pateikti atskirai.

Viena vertus, metileno mėlynas slopina fermentus, skaidančius acetilcholiną. Karvių eritrocitų acetilcholinesterazė buvo konkurenciškai slopinama esant maždaug 0.57 mikromolio litrui koncentracijai, galvijų fermentas — apie 0.42 mikromolio litrui, o žmogaus plazmos esterazės aktyvumas — apie 1.1 mikromolio litrui. Butirilcholinesterazė buvo slopinama maždaug nuo 0.4 iki 5.3 mikromolio litrui, priklausomai nuo rūšies ir preparato, kaip apibendrinta metileno mėlyno poveikio nervų sistemai apžvalgoje. Lėčiau skaidant, sinapsėje lieka daugiau neuromediatoriaus — tuo pačiu principu grindžiamas kelių patvirtintų vaistų nuo Alzheimerio ligos veikimas.

Tačiau šis cheminis poveikis turi sąlygą. Fermentą slopina oksiduota mėlyna forma; redukuota bespalvė forma jo neslopina. Ilgai inkubuojant, kai dažiklis gali redukuotis, silpnesnis slopinimas nustatomas vien dėl šios priežasties. Kiekviena cholinesterazės tyrimo skaitinė reikšmė turi nematomą kintamąjį: kiek dažiklio matavimo metu vis dar buvo mėlynos formos.

Kita vertus, metileno mėlynas blokuoja alpha7 nikotininį receptorių — vieną iš receptorių, kuriuos veikia acetilcholinas. Varlių oocituose ekspresuoti žmogaus alpha7 receptoriai buvo slopinami nekonkurencinio, nuo įtampos nepriklausomo antagonizmo būdu; IC50 buvo apie 3.4 mikromolio litrui, o agonisto veikimo stiprumas nekito. Esant 3 mikromolių litrui koncentracijai, žiurkių hipokampo pjūviuose visiškai išnyko cholino sukelti sinapsiniai atsakai, kaip nurodyta alpha7 receptoriaus tyrime. Taigi, esant panašioms mažoms mikromolinėms koncentracijoms, dažiklis ir išsaugo neuromediatorių, ir susilpnina vieno jo receptoriaus veikimą. Bendro poveikio cholinerginei signalizacijai negalima nustatyti iš kurio nors vieno rezultato. Šis neapibrėžtumas siejasi su platesne literatūra apie Alzheimerio ligą ir su susijusiu pažinimo funkcijų bei ligų tyrimų aptarimu, tačiau čia lieka neišspręstas.

Palyginimas vienoje vietoje

Jautriausią ir mažiausiai jautrų taikinį skiria trys dydžio eilės. Šis koncentracijų skirtumas — visas straipsnis vienoje lentelėje.

Ar šios koncentracijos pasiekiamos smegenyse?

Mėgintuvėlyje gauta skaitinė reikšmė nieko nepasako, jei šalia nėra ekspozicijos reikšmės. Pranešta, kad po vienkartinės maždaug 1.4 mg kilogramui dozės injekcijos į veną vidutinė koncentracija žmogaus plazmoje siekė apie 5 mikromolius litrui, o toje pačioje literatūroje nurodoma, kad išgerta 100 mg dozė lėmė maždaug 0.08 mikromolio litrui koncentraciją visame kraujyje. Pasiskirstymo tyrimuose su žiurkėmis smegenyse nustatomos maždaug dešimt–dvidešimt kartų didesnės koncentracijos nei kraujotakoje. Tačiau tai yra bendras dažiklio kiekis homogenizuotame audinyje, o ne laisvas oksiduotas dažiklis sinapsėje. Be to, maždaug 94 procentų prisijungimas prie plazmos baltymų ir pasiskirstymas kraujo ląstelėse dar labiau mažina laisvąją frakciją.

Lyginant su lentele, vaizdas yra laipsniškas, o ne dvejetainis. MAO-A slopinimas pasireiškia esant gerokai mažesnėms koncentracijoms nei įprasti ekspozicijos lygiai po suleidimo į veną, todėl farmakologiškai toks poveikis tikėtinas, kai dažiklis vartojamas šiuo būdu. Poveikis cholinesterazei ir alpha7 pasireiškia mažų mikromolinių koncentracijų intervale, kurį pasiekia didžiausios koncentracijos po suleidimo į veną, bet kurio įprastos geriamosios dozės gali nepasiekti. GABA-A IC50 — 31 mikromolis litrui — viršija daugumą tikėtinų sisteminės ekspozicijos lygių, todėl būtent šią blokadą sunkiausia laikyti reikšminga viso žmogaus organizme. Kiekvienai šio palyginimo eilutei taikoma ta pati išlyga: svarbi yra laisvo, oksiduoto, ekstraląstelinio dažiklio koncentracija ties taikiniu — dydis, kurio joks kraujo mėginys tiesiogiai neparodo.

Kokių išvadų nedaryti

Nė viena lentelės eilutė neįrodo, kad metileno mėlynas nuspėjamai didina ar mažina kurio nors neurotransmiterio kiekį žmogaus organizme. Fermento slopinimas išgrynintame preparate, pernešiklio blokada ląstelių linijoje ir receptoriaus antagonizmas audinio pjūvyje — kiekvienas jų yra kontroliuojamas eksperimentinis žingsnis, dar atskirtas nuo tikrosios sinapsių veiklos. O cholinerginės sistemos skyriuje matyti, kaip du tikri rezultatai, veikdami priešingomis kryptimis, palieka neapibrėžtumą. Atsakingai šį puslapį reikėtų naudoti kaip taikinių, prie kurių molekulė, kaip parodyta, gali prisijungti, žemėlapį su nurodytu poveikio stiprumu, kad mechanizmų aptarimas remtųsi tuo, kas iš tikrųjų išmatuota. Kaip šie taikiniai susiję su paskirtais vaistais, paaiškinama sąveikų vadove, o papildomo konteksto pateikiama farmakologijos pagrindų ir susijusiame veikimo mechanizmų paaiškinime.