Metileno mėlis ir azoto monoksidas: NOS, cGMP ir signalų perdavimas kraujagyslėse

Klausimas skamba paprastai: ar metileno mėlis slopina azoto monoksidą? Laboratorijoje jis išsiskaido į keturis atskirus klausimus, ir kiekvienam reikia skirtingo eksperimentinio patikrinimo. Jų painiojimas yra pagrindinė priežastis, kodėl tekstai apie metileno mėlį ir azoto monoksidą skamba užtikrintai, bet neaiškiai.

Įsivaizduokite azoto monoksido signalą kaip grandinę iš keturių grandžių. Genas transkribuojamas, kad būtų pagaminta azoto monoksido sintazė. Fermentas argininą paverčia azoto monoksidu. Dujos difuzijos būdu pasiekia savo taikinį, kol dar nesureagavo su kuo nors kitu. Tirpioji guanilato ciklazė jas aptinka ir gamina ciklinį GMP. Publikuotuose tyrimuose aprašytas metileno mėlio poveikis kiekvienai grandžiai, tačiau įrodymai gauti naudojant skirtingas eksperimentines sistemas, skirtingas koncentracijas ir skirtingas izoformas. Vienos grandies rezultatas neįrodo poveikio kitai.

Įprasta grandinė, paaiškinta paprastai

Kraujagyslės sienelėje įprasta seka yra tokia. Dirgiklis paveikia endotelio ląstelę. Endotelio azoto monoksido sintazė, vadinama eNOS arba NOS3, pagamina nedidelį trumpalaikį azoto monoksido kiekį. Dujos difunduoja į gretimą lygiųjų raumenų ląstelę, prisijungia prie tirpiosios guanilato ciklazės hemo su redukuota geležimi ir pagreitina GTP virtimą cikliniu GMP. Ciklinis GMP aktyvina baltymų kinazę G, pasikeičia kalcio apykaita, ir raumuo atsipalaiduoja.

Yra ir antra grandinė, kurią verta aptarti atskirai. Infekcijos metu arba veikiant citokinams ląstelės transkribuoja kito fermento geną: indukuojamosios azoto monoksido sintazės, arba iNOS, dar vadinamos NOS2. Ji sukuria didesnius ir ilgiau trunkančius azoto monoksido srautus nei eNOS. Trečia izoforma, neuroninė NOS, arba nNOS, priklauso dar kitam kontekstui. Kai straipsnyje minima azoto monoksido sintazė nenurodant izoformos, sustokite ir patikrinkite, kuri iš jų buvo matuojama. Apžvalgoje apie tai, kaip metileno mėlis perneša elektronus, tas pats pabrėžiama kalbant apie oksidacijos ir redukcijos taikinius apskritai: pernašos tarpininkas pats savaime nieko nedaro, o rezultatą lemia partneriai abiejuose galuose.

Išmatuotas ciklinio GMP kiekis taip pat yra integruotas rodiklis, o ne tiesioginis fermento aktyvumo tyrimas. Jo lygis atspindi ciklazės vykdomos sintezės ir fosfodiesterazių vykdomo skaidymo skirtumą; kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse ypač svarbi PDE5. Taigi ciklinio GMP sumažėjimas reiškia, kad detektorių pasiekė silpnesnis signalas. Vien šis rodiklis neatskleidžia, kuri grandis sutriko.

1 grandis: pagaminama mažiau iNOS fermento

Pelių makrofaguose, stimuliuotuose bakteriniu lipopolisacharidu, gama interferonu arba abiem, metileno mėlis neleido įvykti tikėtam iNOS baltymo kiekio padidėjimui ir stipriai slopino iNOS informacinę RNR, kaip nustatyta makrofagų transkripcijos eksperimentuose. Svarbu tai, kas nepasikeitė. Inhibitoriaus I kapa B alfa skaidymas, NF kapa B ir STAT1 fosforilinimas bei šių veiksnių patekimas į branduolį iš esmės išliko nepakitę. Sumažėjo jų prisijungimas prie DNR; tai patvirtino chromatino imunoprecipitacija, parodžiusi mažesnį prisijungimą prie iNOS promotoriaus.

Tai genų reguliavimo poveikis, vykstantis prieš pasikeičiant fermento kiekiui, o ne staigus jau esančio fermento blokavimas. Jis susijęs su uždegiminių signalų perdavimu, kai transkripcijos veiksniai turi prisijungti prie promotoriaus, kad atsirastų baltymas. Tai tiesiogiai nieko nepasako apie konstitucinę eNOS ramybės būsenos kraujagyslėje, todėl šį rezultatą reikėtų aprašyti būtent taip.

2 grandis: jau esantis NOS fermentas veikia lėčiau

Tyrime su žiurkėmis buvo vertintas kitas lygmuo. Sąmoningiems žiurkių patinams į veną suleista lipopolisacharido, o po trijų valandų į veną suleista fiziologinio tirpalo arba metileno mėlio, skiriant 3 mg vienam kg. Azoto monoksido sintazės aktyvumas medialinėje bazalinėje pagumburio dalyje buvo matuojamas pagal žymėto arginino virtimą citrulinu pagumburio NOS aktyvumo tyrime. Vien stresas kartu su fiziologiniu tirpalu sukėlė tam tikrą nuo kalcio nepriklausantį aktyvumą, o lipopolisacharidas jį padidino maždaug dešimt kartų, palyginti su kontroliniu lygiu. Metileno mėlis panaikino abu sukeltus aktyvumo komponentus. Nuo kalcio priklausantis konstitucinis aktyvumas tame audinyje, esant tai dozei ir tuo laiko momentu, nepasikeitė.

Šį rezultatą supraskite tiksliai taip, kaip jis pateiktas: tomis sąlygomis nuslopintas išmatuotas iNOS tipo aktyvumas. Tai nėra genų raiškos matavimas ir nėra įrodymas, kad metileno mėlis visada selektyviai veikia iNOS, o ne eNOS ar nNOS. Tyrimai su išgrynintais fermentais dar labiau pagrindžia šį atsargumą. Tiesioginiuose išgrynintos azoto monoksido sintazės tyrimuose metileno mėlis visiškai blokavo citrulino susidarymą esant 30 mikromolinei koncentracijai; pusę aktyvumo slopinanti koncentracija buvo apie 5.3 mikromolinės be superoksido dismutazės ir 9.2 mikromolinės su ja, kaip aprašyta išgrynintos NOS ir guanilato ciklazės palyginime. Atskiras išgrynintos nNOS tyrimas parodė su fermentu susijungusio hemo oksidacijos vaidmenį. Praktinė išvada tokia: tiesioginis NOS slopinimas izoliuotose sistemose yra realus, tačiau pagumburio tyrimo rezultato negalima išplėsti iki bendro teiginio, kad metileno mėlis niekur neveikia jokios konstitucinės NOS.

3 grandis: azoto monoksidas prarandamas dar nepasiekęs taikinio

Aiškiausias įrodymas, kad ciklinio GMP sumažėjimą gali paaiškinti ne vien fermento blokavimas, gautas naudojant kultivuotas triušio plaučių arterijos lygiųjų raumenų ląsteles. Eksperimente endogeninė NOS buvo visiškai apeita tiesiogiai pridedant azoto monoksido donorų, o tada kraujagyslių lygiųjų raumenų superoksido tyrime tikrinta, ar metileno mėlis vis tiek slopina ciklinio GMP atsaką.

Ištirti trys donorai, kurių koncentracijos buvo nuo 1 iki 100 mikromolinių: S nitrozo L cisteinas, natrio nitroprusidas ir stabilus deaminintas analogas, vadinamas MPANO. Visi jie padidino ciklinio GMP kiekį maždaug nuo 1.5 iki 12 kartų. Esant 10 mikromolinei koncentracijai, metileno mėlis pirmųjų dviejų sukeltą atsaką slopino nuo 51 iki 100 procentų, o MPANO sukeltas atsakas liko nepakitęs. Jei metileno mėlis tiesiog blokuotų ciklazės katalizinį centrą, tokį selektyvumą donorų atžvilgiu būtų sunku paaiškinti, nes visi trys galiausiai veikia tą patį tolesnį fermentą.

Tada trys kontroliniai bandymai susiejo šį mechanizmą su superoksidu. Pirma, tarpląstelinio superoksido susidarymas, sukeltas ksantinu kartu su ksantino oksidaze, atkartojo tą patį modelį: CYSNO ir nitroprusido poveikis buvo blokuojamas, o MPANO – ne. Antra, metileno mėlis sukėlė nuo dozės ir laiko priklausantį superoksido susidarymą lygiųjų raumenų ląstelėse, matuotą pagal citochromo c redukciją. Trečia, superoksido dismutazė visiškai užkirto kelią slopinimui, o katalazė – ne. Tai rodo, kad toje eksperimentinėje sistemoje tiesiogiai veikė superoksidas, o ne vandenilio peroksidas.

Verta aprašyti ir eksperimento variantą su bendra ląstelių kultūra, nes jis parodo, kur pasireiškia poveikis. Ant dengiamųjų stiklelių esančios endotelio ląstelės trumpai kultivuotos kartu su lygiųjų raumenų ląstelėmis, todėl bazinėmis sąlygomis išsiskiriantis endotelio veiksnys padidino ciklinio GMP kiekį lygiuosiuose raumenyse nuo trijų iki aštuonių kartų. Išankstinis bet kurios ląstelių grupės apdorojimas metileno mėliu susilpnino šį signalą, o superoksido dismutazė iš dalies panaikino išankstinio endotelio apdorojimo poveikį. Kitaip tariant, metileno mėlis visai nebūtinai turi veikti lygiųjų raumenų ląstelės, aptinkančios signalą, viduje. Jis gali susilpninti signalą pašalindamas signalinę molekulę jai keliaujant. Metileno mėlio tyrimų skaitymo vadove tai pateikiama kaip bendroji taisyklė: prieš įvardydami molekulinį taikinį, nurodykite, kuriame skyriuje atlikta intervencija.

Vadinti tai NOS slopinimu būtų klaidinga. Donorams veikti nereikėjo jokio sintazės etapo, tačiau signalas vis tiek susilpnėjo.

4 grandis: pats detektorius reaguoja silpniau

Tiesioginis poveikis tirpiajai guanilato ciklazei egzistuoja, tačiau koncentracijos yra svarbios. Pirmiau minėtame išgrynintų fermentų palyginime, norint perpus nuslopinti azoto monoksido stimuliuojamą ciklazę, reikėjo maždaug 60 mikromolinės metileno mėlio koncentracijos, o NOS pusiniam slopinimui pakako maždaug nuo 5 iki 9 mikromolinės koncentracijos. Net 1 milimolinė koncentracija nesukėlė visiško blokavimo. Tai maždaug nuo šešių iki vienuolikos kartų skirtumas. Todėl ląstelių eksperimento, kuriame nedidelė mikromolinė koncentracija sumažina ciklinio GMP kiekį, negalima laikyti selektyviu ciklazės slopinimu remiantis vien ciklinio GMP rodikliu.

Vėlesnis oksidacijos ir redukcijos tyrimas pateikė dar vieną priežastį būti atsargiems: metileno mėlis deaktyvino azoto monoksido aktyvintą ciklazę mechanizmu, kuris skyrėsi nuo paprastos hemo geležies oksidacijos ore. Taigi detektoriaus veikla gali sutrikti, tačiau cheminis mechanizmas dar nėra galutinai išaiškintas. Koncentracijų skirtumas reiškia, kad esant nedidelėms mikromolinėms koncentracijoms pirmiausia reikėtų atmesti superoksido ir NOS poveikį. Čia taip pat svarbi fosfodiesterazių kontrolė. Jei skaidymas nebuvo matuotas arba blokuotas, sumažėjęs ciklinio GMP kaupimasis gali reikšti mažesnę sintezę, greitesnį skaidymą arba abu procesus.

Kodėl to negalima suvesti į vieną teiginį apie kraujospūdį

Kiekviena grandis nustatyta skirtingoje sistemoje. Makrofagų transkripcija nėra pagumburio fermento aktyvumas. Pagumburio aktyvumas po lipopolisacharido poveikio nėra ramybės būsenos endotelio tonusas. Bazinėmis sąlygomis bendroje kultūroje išsiskiriantis endotelio veiksnys nėra agonisto stimuliuojama vazodilatacija. Kultivuotos plaučių arterijos ląstelės, veikiamos 10 mikromolinės metileno mėlio koncentracijos, nėra žmogaus kraujotaka. Suvedus visa tai į teiginį, kad metileno mėlis didina kraujospūdį blokuodamas azoto monoksidą, prarandami būtent tie skirtumai, kuriems išsaugoti ir buvo skirtos kontrolės.

Trys patikros padeda išlaikyti paaiškinimo tikslumą. Pirma, įvardykite izoformą: eNOS – ramybės būsenos kraujagyslių tonusui, iNOS – sukeltam uždegiminiam srautui, nNOS – neuronų ir kai kurių išgrynintų fermentų tyrimų kontekstams. Antra, įvardykite, kaip perduodamas azoto monoksido signalas: endogeninė sintezė, bazinis išsiskyrimas iš endotelio ar konkretus donoras, pavyzdžiui, CYSNO, nitroprusidas arba MPANO, nes stabilus donoras buvo atsparus metileno mėliui, o labilūs – ne. Trečia, įvardykite koncentraciją ir poveikį panaikinančią kontrolę: superoksido dismutazės atkuriamas atsakas rodo superoksido vaidmenį, katalazės neveiksmingumas prieštarauja vandenilio peroksido vaidmeniui toje sistemoje, ksantino oksidazės gebėjimas atkartoti poveikį rodo mechanizmo pakankamumą, o išgrynintų fermentų tyrimai atskiria tiesioginį poveikį katalizei nuo signalo praradimo jam keliaujant.

Trumpa apibendrinanti išvada tokia. Metileno mėlį tiksliau laikyti keliose vietose azoto monoksido–ciklinio GMP signalų perdavimą trikdančia medžiaga, o ne selektyviu ciklazės blokatoriumi. Priklausomai nuo eksperimentinės sistemos ir koncentracijos, jis gali sumažinti iNOS transkripcijos veiksnių prisijungimą, tiesiogiai slopinti NOS fermentus, mažinti azoto monoksido prieinamumą skatindamas superoksido susidarymą ir sutrikdyti azoto monoksido aktyvintos ciklazės veiklą. Ciklinio GMP signalų perdavimo vaidmuo kraujagyslių tyrimuose ir ląstelių tyrimuose naudojamų azoto monoksido donorų palyginimas išsamiau aptaria po vieną iš šių mechanizmo šakų, o metodai, naudojami oksidacijos ir redukcijos poveikiui atskirti nuo poveikio fermentams paaiškina, kodėl šioje literatūroje taip dažnai kartu naudojamos superoksido dismutazės, katalazės ir stabilaus donoro kontrolės.

Mažas ciklinio GMP rodiklis po metileno mėlio poveikio rodo nutrūkusią grandinę. Tik kontroliniai bandymai pasako, kuri grandis nutrūko.