Metileno mėlio antimikrobiniai ir priešgrybeliniai tyrimai: šviesoje ir tamsoje

Du skaitytojai, pamatę frazę „metileno mėlio antimikrobinis poveikis“, įsivaizduoja skirtingus dalykus. Vienas įsivaizduoja mėlyną skystį, kuris nuodija mikrobus vos su jais susilietęs. Kitas – procedūrą, per kurią dažiklis kartu su raudona šviesa juos sunaikina. Abiejuose vaizdiniuose yra dalis tiesos. Nė vienas nėra išsamus, o juos supainiojus atsiranda dauguma klaidingų teiginių internete.

Šioje apžvalgoje nagrinėjamas būtent šis skirtumas. Pakankamos koncentracijos metileno mėlis tamsoje pasižymi nedideliu toksiškumu. Veikiamas raudonos šviesos jis tampa fotosensibilizatoriumi: sugeria fotoną, pereina į reaktyvią tripletinę būseną ir sukelia oksidacines reakcijas, kurios vienu metu pažeidžia daug taikinių. Šis šviesa aktyvinamas veikimo režimas turi atskirą pavadinimą – antimikrobinė fotodinaminė terapija – ir savas sąlygas. Vien koncentracija jo neapibrėžia. Rezultatą lemia bangos ilgis, šviesos dozė, inkubacija, deguonis ir organizmas.

Dvi naikinimo sampratos

Pirmiausia aptarkime veikimą tamsoje. Metileno mėlis yra teigiamą krūvį turintis fenotiaziniumų grupės dažiklis. Jis sąveikauja su mikroorganizmų apvalkalais, skirtingu mastu patenka į ląsteles ir dalyvauja oksidacijos-redukcijos bei jungimosi reakcijose. Fotonai čia nedalyvauja. Mikroorganizmai žūsta, tačiau tik esant koncentracijoms, kurios labai skiriasi priklausomai nuo organizmo, o veikimo mechanizmas nėra nukreiptas į vieną aiškų taikinį.

Fotodinaminio veikimo atveju prisideda šviesa. Raudonos šviesos fotonai, kurių bangos ilgis yra maždaug nuo 630 iki 680 nm, patenka į dažiklio sugerties juostą; monomero sugerties maksimumas yra ties maždaug 664 nm. Sugėręs šviesą dažiklis pereina į trumpaamžę singletinę būseną, o vėliau – į ilgiau išliekančią tripletinę būseną. Toliau vyksta dviejų tipų reakcijos. I tipo reakcijose tripletinės būsenos dažiklis perduoda elektroną substratui ir inicijuoja radikalines reakcijas, kuriose susidaro superoksido ir hidroksilo dalelės. II tipo reakcijose jis perduoda energiją tiesiogiai pagrindinės būsenos deguoniui ir sukuria singletinį deguonį. Abu procesai gali vykti vienu metu, todėl vadinti dažiklį vien singletinio deguonies šaltiniu būtų pernelyg paprasta. Fenotiaziniumų grupės fotosensibilizatorių struktūros ir aktyvumo ryšio apžvalga tai parodo tiesiogiai: giminingų dažiklių fototoksiškumas bakterijoms priklausė ne vien nuo singletinio deguonies išeigos, nes patekimas į ląsteles, lokalizacija ir redukcija į neaktyvią leukoformą buvo tokie pat svarbūs kaip fotofizika. Fotochemija, kuria grindžiamas bangos ilgio pasirinkimas, paaiškinta susijusioje dažiklio ir raudonos šviesos derinio apžvalgoje.

Singletinis deguonis lemia vieną naudingą savybę. Jis vienu metu reaguoja su daugeliu biomolekulių, todėl poveikis yra daugialypis, o ne nukreiptas į vieną fermentą ar jungiantį baltymą. Pamatiniame fotodinaminės antimikrobinės chemoterapijos aprašyme tai buvo įvardyta kaip priežastis, dėl kurios įprastiniai atsparumo profiliai turi mažai reikšmės: papildomas peniciliną jungiantis baltymas ar mutavusi topoizomerazė nesustabdo reaktyviųjų deguonies formų pliūpsnio. Ši logika pasitvirtino atliekant bandymus su meticilinui atspariais Staphylococcus aureus ir vankomicinui atspariais enterokokais, kaip matyti toliau pateiktoje lentelėje. Tai nereiškia, kad atsparumas neįmanomas – tik kad jis veikia kitaip. Išstūmimo siurbliai ir antioksidacinės apsaugos mechanizmai vis tiek gali pakeisti reikalingą dozę, ypač grybų atveju.

Organizmų ir tyrimų modelių lentelė

Ši lentelė yra pagrindinė straipsnio dalis. Kiekviena reikšmė priklauso nuo konkretaus protokolo: tas pats dažiklis, bet kitokia šviesos dozė ar inkubacija – ir gaunamas kitoks skaičius. Nelaikykite MBC, MLC ir MIC lygiaverčiais rodikliais. MBC ir MLC čia reiškia, kad persėjus neaptikta išgyvenusių mikroorganizmų, o MIC reiškia augimo slopinimą. Kiekvienoje eilutėje pateiktos apšvietimo sąlygos.

Organizmas ir modelis	Rezultatas tamsoje	Rezultatas šviesoje	Sąlygos
S. aureus NCTC 6571, planktoninė suspensija	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Apžvalgos lentelė, balta šviesa 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, planktoninė suspensija	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Pirminis 1997 m. protokolas, 1.7 mW per cm2 1 valandą, apie 6.3 J per cm2, inokuliumas apie 10^6 CFU per mL, pateikta pirminiame fenotiaziniumų fotobaktericidinio poveikio tyrime
MRSA EMRSA-15, planktoninė forma	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Apžvalgos lentelė, apie 12 J per cm2, keturgubai padidėjęs jautrumas
MRSA EMRSA-16, planktoninė forma	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Tas pats protokolas kaip aukščiau
E. coli NCTC 9001, planktoninė forma	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Tas pats protokolas, penkiagubai padidėjęs jautrumas
P. aeruginosa NCTC 10622, planktoninė forma	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Tas pats protokolas, dvidešimt kartų padidėjęs jautrumas
E. faecalis NCTC 775, planktoninė forma	MLC 100 uM	MLC 100 uM	1997 m. protokolas, 6.3 J per cm2, šiai padermei ir dozei pagerėjimo nebuvo
Vankomicinui atsparūs E. faecium, planktoninė forma	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Apžvalgos lentelė, pradinis dažiklis pagerėjimo nesuteikė, o hidrofobiškesni metilinti dariniai jį suteikė, pagal vankomicinui atsparių enterokokų tyrimą
Candida albicans, planktoninė forma	MIC daugiau kaip 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 ir 1.59 ug per mL, esant 5, 10 ir 15 J per cm2	30 minučių išankstinė inkubacija tamsoje, raudonas LED nuo 600 iki 650 nm, maksimumas ties 635 nm, pagal metileno mėlio priešgrybelinio fotodinaminio poveikio priklausomybės nuo dozės tyrimą
C. albicans YEM14 ir padermė su padidėjusia išstūmimo siurblių raiška, naikinimas pagal CFU	Netaikoma	Pradinės padermės sumažėjimas apie 5 log, CDR1/CDR2 padidėjusios raiškos padermės naikinimas beveik nulinis	100 uM dažiklio, 30 minučių inkubacija, 660 nm ir 60 J per cm2, pagal išstūmimo siurblių poveikio metileno mėlio fotonaikinimui tyrimą
Trichophyton rubrum hifai ir sporos	Netaikoma	Hifų MIC apie 6.3 ug per mL, sporų apie 2.0 ug per mL; visiškam CFU susidarymo blokavimui hifams reikėjo 5 ug per mL ir 100 J per cm2, o sporoms – 1.25 ug per mL ir 40 J per cm2	635 nm fotodinaminis protokolas, pagal dermatofitų vystymosi stadijų jautrumo tyrimą
Brandi 33 rūšių podanteninė bioplėvelė, Calgary įrenginys, 6 diena	Vien MB sumažino bendrą skaičių daugiau kaip 80 procentų	MB ir 660 nm LED sumažino metabolinį aktyvumą apie 55 procentus, plataus masto bendrijos persitvarkymo nebuvo	0.01 procento dažiklio (100 ug per mL), 660 nm ir apie 330 mW per cm2 5 minutes, anaerobinis augimas, pagal kelių rūšių burnos bioplėvelės tyrimą in vitro

Išryškėja trys dėsningumai. Pirma, gramteigiami stafilokokai žūsta esant mažoms mikromolinėms koncentracijoms, o gramneigiamoms lazdelėms tamsoje reikia maždaug šimtą kartų daugiau dažiklio, nes gramneigiamų bakterijų išorinė membrana riboja jo patekimą. Šviesa sumažina šį skirtumą, bet jo nepanaikina. Antra, metileno mėlio priešgrybelinis poveikis yra tikras, tačiau priklauso nuo sąlygų: Candida naikinimas metileno mėliu smarkiai didėja didinant šviesos dozę, o vienas fenotipo pokytis, pavyzdžiui, padidėjusi išstūmimo siurblių raiška, gali panaikinti 5 log sumažėjimą esant tai pačiai dozei. Trečia, brandi bioplėvelė elgiasi kitaip nei suspensijos; būtent šį skirtumą iliustruoja burnos bioplėvelės eilutė.

Bakterijos: kada šviesa padeda labiausiai, o kada nepadeda

Stafilokokai yra jautrusis atvejis. Net apžvalgos lentelėje pateiktos epideminių MRSA reikšmės, pritaikius šviesą, yra lygios lyginamojo vankomicino rodiklio reikšmėms arba mažesnės. Dimetilinti dariniai veikė dar geriau, nes metilinimas padidino lipofiliškumą ir singletinio deguonies išeigą bei sumažino polinkį redukuotis į leukoformą. Ši cheminė detalė svarbi: ji rodo, kad naikinimas priklauso nuo patekimo ir fotofizikos derinio, o ne vien nuo fotofizikos.

Gramneigiami organizmai iliustruoja patekimo svarbą. Pseudomonas tamsoje reikėjo 500 uM, o šviesoje – 25 uM: dvidešimt kartų mažiau, tačiau net ir šviesoje nustatyta reikšmė gerokai viršija stafilokokams būdingą diapazoną. Katijoninis krūvis padeda dažikliui priartėti prie išorinės membranos, tačiau prasiskverbimas išlieka ribojantis veiksnys. Preparato sudėtis, inkubacijos trukmė ir darinio pasirinkimas šiuos skaičius keičia labiau nei to paties dažiklio naudojimas didesne doze.

Enterokokai primena, kad reikia atsargumo. Pagal senesnius protokolus E. faecalis atveju šviesa nesuteikė jokio pranašumo, o vankomicinui atspariems E. faecium reikėjo kitos molekulės, ne daugiau šviesos. Tas, kas vieną metileno mėlio MBC reikšmę pateikia kaip bendrą antibakterinę konstantą, neteisingai interpretuoja literatūrą. Tokios konstantos nėra. Yra tik konkrečiai padermei, terpei, inokuliumui, inkubacijai, bangos ilgiui ir energijos tankiui būdingos reikšmės. Kaip jas skaityti neapsigaunant, aptariama mikroorganizmų žuvimo kreivių interpretavimo vadove.

Grybai: jautrūs, bet rezultatą lemia stadija ir siurbliai

Grybų sienelės, sudarytos iš gliukanų, mananų ir chitino, kelia kitokią patekimo problemą nei bakterijų sienelės, be to, grybai turi aktyvių apsaugos mechanizmų. Aukščiau pateiktas Candida išstūmimo siurblių rezultatas yra ryškiausias pavyzdys: tas pats dažiklis, ta pati šviesa, ta pati terpė, tačiau padidėjusios raiškos padermė išgyveno, o pradinė padermė prarado apie 99.999 procento kolonijas sudarančių vienetų. Dermatofitų atveju prisideda vystymosi stadija. Sporos žūsta gerokai lengviau nei hifai, todėl protokolas, kuris sunaikina sporas, naudojant tą pačią dozę gali palikti gyvybingų hifų fragmentų.

Todėl pranešimuose apie metileno mėlio priešgrybelinį poveikį apšvietimo sąlygos turi būti aprašomos taip pat tiksliai kaip bakterijų tyrimuose. Klinikiniuose fotodinaminiuose nagų ir odos tyrimuose 1–2 procentų dažiklis buvo derinamas su išmatuota raudona šviesa, apibrėžtu energijos tankiu ir vėlesniu stebėjimu, o klinikinė išvaizda buvo vertinama atskirai nuo mikologinio sukėlėjo pašalinimo. Šie tyrimai apžvelgiami nagų ir odos grybelių fotodinaminio poveikio įrodymų santraukoje. Pažeistos vietos patepimas praskiestu dažikliu kambario šviesoje atkuria spalvą, bet ne pačią procedūrą.

Bioplėvelės patikra: 33 rūšių burnos modelis

2024 m. kelių rūšių burnos bioplėvelės tyrimas vertas dėmesio, nes jame tiriamas sudėtingas, o ne lengvas atvejis. Trisdešimt trys burnos mikroorganizmų rūšys, įskaitant Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium ir burnos streptokokus, anaerobinėmis sąlygomis iki 6 dienos suformavo brandžią bioplėvelę. Buvo naudojamas 0.01 procento dažiklis ir 660 nm LED, apšviečiant 5 minutes dideliu apšvitos intensyvumu. Tiek vien dažiklis, tiek vien šviesa gerokai sumažino bendrą skaičių, o jų derinys sumažino metabolinį aktyvumą maždaug perpus, tačiau bendrija nepersitvarkė ir bioplėvelė nebuvo sterilizuota.

Tai tikras poveikis, kurio ribos aiškiai pripažįstamos. Jis pagrindžia fotodinaminį gydymą kaip vietinę papildomą priemonę išvalytoje periodonto kišenėje, o ne kaip skalavimo skystį, kuris vienas gydytų diagnozuotą periodontitą. Taip prieiname prie bendresnio atotrūkio.

Kodėl naikinimas laboratorijoje nėra tas pats, kas gydymas

Nustatant planktoninių mikroorganizmų MBC, vienodos ląstelės veikiamos tolygiai pasiskirsčiusiu dažikliu ir vienoda šviesa deguonies turinčioje terpėje. Pažeistoje vietoje nėra nė vienos iš šių sąlygų. Matrica lėtina patekimą, į persistuojančių ląstelių būsenas panašios būsenos padeda toleruoti oksidaciją, kraujas ir eksudatas sugeria šviesą, audinių geometrija palieka šešėlių, o hipoksinės kišenės silpnina II tipo reakcijas, nes singletiniam deguoniui susidaryti būtinas molekulinis deguonis. Mišriose infekcijose yra rūšių, kurių dažiklio pasisavinimas ir jautrumas skiriasi, todėl vienos etaloninės padermės reikšmė negali apibūdinti visos vietos.

Burnos pavyzdys šį atotrūkį parodo konkrečiai. Porphyromonas ar streptokokų kiekio sumažinimas lėkštelėje arba išaugintos bioplėvelės nuslopinimas perpus neįrodo, kad mėlynas skalavimo skystis gydo periodontitą, išgydo endodontinę infekciją ar pašalina bakteriemiją. Klinikinė periodonto priežiūra remiasi mechaniniu bioplėvelės suardymu ir pašalinimu bei kišenės anatomijos koregavimu, o šviesa pagrįstas gydymas tiriamas kaip vietinė papildoma priemonė. Dažiklio koncentracija, kuri naikina mikroorganizmus laboratorinės plokštelės šulinėlyje, neturi pastovaus ryšio su koncentracija, kuri pasiekia bakterijas po dantenų kraštu, o kambario šviesa nėra 660 nm šviesos dozė. Bet kokio naudojimo burnoje dozavimo, saugumo ir sąveikų ribas turi nustatyti gydytojas, kaip aptariama saugumo ir sąveikų žinyne.

Ko šie įrodymai nepatvirtina

Jie nepatvirtina teiginio apie buitinę dezinfekavimo priemonę. Baktericidinio poveikio lentelėse naudojamos apibrėžtos padermės, terpės, sąlyčio trukmės, spektrai ir energijos tankiai. Jos nieko nepasako apie virtuvės paviršius, reikalingą sąlyčio trukmę esant organiniams nešvarumams ar teisės aktuose nustatytus dezinfekavimo standartus.

Jie taip pat nepatvirtina, kad tai sisteminių antibiotikų pakaitalas. Įprastiniam fotodinaminiam poveikiui reikia dažiklio, sugertos šviesos ir deguonies toje pačioje vietoje tuo pačiu metu. Šviesa nepasiekia gilių ar išplitusios infekcijos vietų taip, kaip nurytas vaistas pasiekia kraują. Literatūroje šis metodas siejamas su pasiekiama vietine infekcija arba papildomu gydymu – būtent taip Wainwright nuo pat pradžių apibūdino vietinę dezinfekciją.

Sąžininga išvada yra siauresnė, bet vis tiek įdomi. Metileno mėlis tamsoje pasižymi nedideliu antimikrobiniu aktyvumu, o raudona šviesa sukelia gerokai stipresnį fotodinaminį poveikį daugeliui bakterijų ir grybų. Skirtumai tarp šviesos ir tamsos sąlygų gali būti dideli, pavyzdžiui, nuo 500 iki 25 uM Pseudomonas atveju ir nuo 80 iki 20 uM epideminių MRSA atveju, tačiau kartu nustatyta pamokančių nesėkmių su enterokokais ir Candida, turinčiomis veiksmingus išstūmimo mechanizmus. Rezultatų pritaikymą praktikoje lemia ne tik nominali dažiklio koncentracija, bet ir jo patekimas, bioplėvelės fiziologija bei deguonis. Kai šios sąlygos aiškiai nurodytos, skaičiai turi prasmę. Jas pašalinus, jie nieko nereiškia.