Loefflerio šarminis ir polichrominis metileno mėlynasis: dažymo tirpalų paaiškinimas

Ant dažymo laboratorinio stalo greta gali stovėti trys buteliukai, kurių kiekvieno etiketėje nurodytas vis kitoks metileno mėlynojo variantas. Ant vieno parašyta: vandeninis metileno mėlynasis, 1%. Ant kito – Loefflerio šarminis metileno mėlynasis. Ant trečio – polichrominis metileno mėlynasis. Skubantis darbuotojas paima artimiausią. Tuomet tepinėlis nusidažo per silpnai, pernelyg vienodai mėlynai arba netikėtais violetiniais atspalviais, o dėl rezultato kaltinamas mėginys.

Tai tirpalo sudėties, o ne mėginio problema. Šiuose trijuose tirpaluose yra giminingų dažiklių, tačiau jų dažymo principai skiriasi. Vienas yra paprastas katijoninis dažiklis, kurio tirpalo pH artimas neutraliam. Kitas – tas pats dažiklis, kurio poveikį sustiprina šarmas. Trečiasis jau visai ne vienas dažiklis, o sąmoningai oksiduotas mišinys. Pasirinkus netinkamą tirpalą, pasikeičia pats dažymo principas.

Trumpas atsakymas

Paprastas vandeninis metileno mėlynasis yra atskaitos taškas: maždaug 1% dažiklio vandenyje, paprastas katijoninis dažymo tirpalas bakterijų morfologijai ir bendrajai mikroskopijai. Ruošiant Loefflerio šarminį metileno mėlynąjį, į vandeniu praskiestą alkoholinį pradinį tirpalą įpilamas nedidelis tiksliai pamatuotas praskiesto šarmo kiekis. Tai padidina pH ir sustiprina katijoninio dažiklio prisijungimą prie rūgštinių bakterijų struktūrų. Polichrominis metileno mėlynasis yra metileno mėlynasis, sąmoningai brandintas oksiduojant šarminėje terpėje. Todėl buteliuke kartu su likusiu metileno mėlynuoju yra demetilintų homologų (azure A, azure B, azure C), tionino ir metileno violetinio mišinys, kuris skirtingas struktūras nudažo skirtingais atspalviais.

Jei įsiminsite tik vieną sakinį: šarminimas keičia dažymo intensyvumą, o polichrominimas – dažymo spalvas.

Įprastas vandeninis metileno mėlynasis: atskaitos taškas

Paprasčiausias tirpalas – vandenyje ištirpintas metileno mėlynasis, paprastai 1% w/v koncentracijos, be šarmo ir neoksiduotas. Spalvą suteikianti dalelė yra metiltioninio katijonas su chlorido priešjoniu – nedidelis plokščias fenotiazino dažiklis, PubChem metileno mėlynojo įraše aprašytas kaip metiltioninio chloridas. Būdamas katijonu, jis jungiasi prie nukleorūgščių fosfatinio karkaso ir rūgštinių grupių bakterijų ląstelių sienelėse, nudažydamas ląsteles mėlynai šviesiame fone.

Jo privalumas – nuspėjamumas. Branduoliai ir bakterijos atrodo mėlyni. Kontrastas nedidelis. Sunkiai įžiūrimi mikroorganizmai gali nusidažyti silpnai – būtent šį trūkumą Loeffleris ir siekė pašalinti. Apie platesnę paprastųjų bakterijų dažymo tirpalų grupę, kuriai priklauso šis tirpalas, skaitykite paprastojo bakterijų dažymo apžvalgoje. Tikslus dažiklio tapatybės nustatymas svarbus ir čia: metilo mėlynasis yra visiškai kita molekulė, kaip paaiškinta straipsnyje metilo mėlynasis ir metileno mėlynasis, todėl kataloge ieškant vien pagal spalvos pavadinimą galima pasirinkti ne tos klasės dažiklį.

Loefflerio šarminis metileno mėlynasis: tas pats dažiklis, stipresnis dažymas

Pagal klasikinį Loefflerio receptą alkoholinis pradinis metileno mėlynojo tirpalas sumaišomas su praskiestu vandeniniu šarmo tirpalu. Vadovėliuose pateikiamuose variantuose nurodoma 0.3 g dažiklio ištirpinti 30 mL 95% etanolio ir įpilti 100 mL 0.01% vandeninio kalio hidroksido tirpalo (arba lygiavertiškai naudoti 30 mL sotaus alkoholinio metileno mėlynojo tirpalo, 100 mL distiliuoto vandens ir 1 mL 1% KOH). Taip gaunamas darbinis tirpalas, kuriame dažiklio koncentracija artima 0.3%, o pH aiškiai šarminis. Komerciniai variantai paremti tuo pačiu principu, o Thermo Fisher mikrobiologinių dažymo tirpalų kataloge Loefflerio šarminis metileno mėlynasis, polichrominis ir vandeninis variantai pateikiami kaip atskiri katalogo produktai, turintys skirtingas numatytas paskirtis.

Esminis veiksnys yra šarmas. Padidinus pH, mėginio karboksilo ir fosfato grupės deprotonuojamos, todėl padidėja neigiamai įkrautų vietų tankis. O alkoholiniame pradiniame tirpale dažiklis išlieka visiškai ištirpęs, tad šias vietas pasiekia monomerų pavidalu. Dėl to bakterijos nusidažo greičiau ir intensyviau nei neutraliu vandeniniu dažiklio tirpalu: įprastame bakteriologiniame tepinėlyje matomos gerai pažįstamos sodriai mėlynos lazdelės ir kokai. Paprastai dažoma nuo vienos iki trijų minučių, paskui nuplaunama vandeniu.

Klasikinis taikymas – Corynebacterium diphtheriae, išaugintos Loefflerio serumo terpėje: plonos, dažnai buožės formos lazdelės su ryškiai nusidažiusiomis metachromatinėmis Babes-Ernst granulėmis, kuriose kaupiamas polifosfatas. Terpės ir dažymo tirpalo derinys istoriškai susijęs – abu priskiriami tam pačiam bakteriologui, o diagnostinė nauda yra granulių kontrastas. Be difterijos tyrimų, šis tirpalas naudojamas bendram bakteriologiniam kultūrų tepinėlių dažymui, Neisseria morfologijai klinikiniuose tepinėliuose vertinti ir tais atvejais, kai Gramo dažymas nereikalingas, tačiau paprastu vandeniniu mėlynuoju nusidažo per silpnai. Tai monochrominis dažymo tirpalas. Visos rūgštinės struktūros nusidažo vienokiu ar kitokiu mėlynu atspalviu. Kai protokole numatytas diferencinis dažymas skirtingomis spalvomis, vien šarmo tam nepakanka.

Vienas praktinis įspėjimas: laikomi šarminiai dažiklių tirpalai, sugerdami anglies dioksidą, prastėja ir juose susidaro nuosėdų. Laboratorijos arba ruošia nedidelius kiekius, arba perka kataloge siūlomą tirpalą ir laikosi jo tinkamumo termino, užuot toliau naudojusios seną buteliuką, iš kurio nuosėdos jau patenka ant kiekvieno objektinio stiklelio.

Polichrominis metileno mėlynasis: vienas pavadinimas, keli dažikliai

Polichrominis metileno mėlynasis ruošiamas iš to paties dažiklio, tačiau jis kontroliuojamai oksiduojamas šarminėje terpėje. Istoriškai šis procesas vadintas brandinimu arba polichrominimu. Brandinant šarminėje terpėje, kaitinant su karbonatu arba oksiduojant tokiomis medžiagomis kaip dichromatas, nuo dimetilamino pakaitų palaipsniui pašalinamos metilo grupės. Gaunamas mišinys: likęs metileno mėlynasis, azure B (netekęs vienos metilo grupės), azure A ir azure C (toliau demetilinti junginiai), tioninas (visiškai demetilintas junginys) ir metileno violetinio grupės oksidaciniai šalutiniai produktai. Kiekvienas komponentas turi savo atspalvį ir afinitetą audiniams, todėl mišinys dažo metachromatiškai: branduoliai, granulės, mucinai ir kremzlė įgauna skirtingus atspalvius nuo mėlyno iki raudonai violetinio.

Ši chemija yra ir garsiųjų kraujo dažymo tirpalų pagrindas. Ankstyvieji tyrėjai nustatė, kad pašarmintas metileno mėlynasis maliarijos parazitų branduolius nudažo violetiniais atspalviais, tačiau jų vandeniniai brandinti tirpalai buvo nestabilūs ir per kelias dienas iškrisdavo nuosėdomis. Apžvalgoje kaip buvo išrastas violetinis kraujo dažymo tirpalas aprašoma, kaip Malachowski ir Romanowsky nepriklausomai vienas nuo kito pasinaudojo šiuo efektu 1891 metais, kaip buvo pradėtas naudoti metanolis dažiklio nuosėdoms stabilizuoti ir tepinėliams fiksuoti nekaitinant, ir kaip vėliau Giemsa standartizavo mišinį, naudodamas tiksliai pamatuotus azure B ir eozino kiekius bei stabilizuodamas gliceroliu. Šiuolaikiniai Giemsa tipo dažymo tirpalai tiesiogiai kilo iš polichrominio metileno mėlynojo ir eozino – derinio, sukeliančio Romanowsky efektą. Išsamiau apie derinimą su eozinu ir azure B komponentą skaitykite straipsnyje Romanowsky tipo dažymo tirpalai ir azure B sąveika su eozinu.

Kadangi polichrominis metileno mėlynasis yra mišinys, jis iš prigimties mažiausiai standartizuotas iš šių trijų tirpalų. Tikslus jo atspalvių balansas priklauso nuo oksidacijos būdo ir laipsnio. Todėl histologijos priemonių tiekėjai jį parduoda kaip atskirą produktą, kuriam atliekami atskiri veikimo bandymai, o ne kaip pasenusį Loefflerio tirpalą. Įprastos paskirtys – metachromatinis putliųjų ląstelių granulių, mucinų ir kremzlės išryškinimas, plazminių ląstelių detalių atskleidimas ir Helicobacter pylori nustatymas audinių pjūviuose Goodpasture tipo polichrominiais metodais. Tai tinkamas pasirinkimas, kai reikia atskirti struktūras pagal spalvą, ir netinkamas, kai pagal protokolą tikimasi aiškaus monochrominio bakterijos silueto.

Sudėties ir paskirties palyginimas

Lentelę skaitykite kaip pasirinkimo algoritmą. Jei mėginys nusidažo per silpnai, keiskite pH principą ir rinkitės Loefflerio tirpalą. Jei viskas nusidažo, bet niekas neišsiskiria, keiskite dažiklių principą ir rinkitės polichrominį tirpalą. Jei Loefflerio tirpalu dažytame tepinėlyje granulės matomos puikiai, bet vadovas klausia, kodėl branduoliai ir citoplazma yra vienodai mėlyni, atsakymas toks: joks šarminis monochrominis dažymo tirpalas negali jų atskirti skirtingomis spalvomis. Šiam uždaviniui skirta polichrominių tirpalų grupė ir jos kraujo dažymo dariniai.

Kaip išvengti įprastų painiavų

Didžiąją dalį painiavos sukelia dvi klaidos. Pirmoji – Loefflerio tirpalą laikyti lygiaverčiu paprastam metileno mėlynajam, nes abu buteliuke atrodo mėlyni. Jie skiriasi pH ir dažymo intensyvumu, todėl vietoj nurodyto Loefflerio tirpalo panaudojus neutralų dažiklį prarandamas būtent tas granulių kontrastas, kuriam buvo pritaikytas protokolas. Antroji – bet kokį seną ar atsitiktinai pasenusį šarminį mėlynąjį laikyti polichrominiu. Nekontroliuojamai senstant susidaro nežinomos sudėties ir koncentracijos mišinys, o tikri polichrominiai tirpalai ruošiami nustatytais oksidacijos būdais ir, kraujo dažymo tirpalų atveju, derinami su tiksliai pamatuotu eozino kiekiu. Istorija čia pamokanti: nestabilius XIX a. paskutinio dešimtmečio vandeninius brandintus tirpalus pakeitė stabilizuoti metanoliniai tirpalai būtent todėl, kad nekontroliuojamų mišinių nebuvo įmanoma atkartoti. Šią pamoką verta prisiminti prieš dažant diagnostinį preparatą tirpalu iš nežinomo senumo buteliuko.

Tiksli pavadinimų patikra užbaigia pasirinkimą. Etiketėje patikrinkite katalogo produktą (vandeninis, Loefflerio ar polichrominis), dažiklio kiekį ir numatytą paskirtį, užuot sprendę pagal spalvą. Šie trys tirpalai turi bendrą chromoforo pirmtaką. Tačiau jų paskirtis nėra ta pati.