Kann Methylenblo de mitochondriale Komplex III ëmgoen? Firwat Studie sech widderspriechen

Zwee Laboratoiren hunn ënnersicht, ob Methylenblo e blockéierte mitochondriale Komplex III ëmgoe kann. Deen een huet mat Nee geäntwert. Deen anere mat Jo. Béid haten Donnéeën.

Déi éischt Studie, mat Mitochondrien aus dem Gehier vu Mais, huet festgestallt, datt de Faarfstoff dat net kann. Déi zweet, mat Gehirmitochondrien aus dräi Nagedéierenaarte, huet festgestallt, datt en et deelweis kann. Eng drëtt Studie, mat Maisliewer, gëtt dacks an deem Zesummenhang zitéiert, huet awer eppes anescht getest. Wann een se richteg anuerdent, kläert sech schonn d'Hallschent vun der Verwirrung.

Et gëtt keen universelle Mechanismus ze verkënnegen. Et ginn dräi Versich mat ënnerschiddleche Blocker, Dosissen a Moosswäerter. Liest fir d'éischt d'Bedéngungen. D'Konklusioune kommen duerno.

Wat ëmgoen hei bedeit

Elektrone kommen iwwer Komplex I (aus NADH) oder Komplex II (aus Succinat) an d'Ketten, ginn iwwer Komplex III un Cytochrom c weider an duerno iwwer Komplex IV un de Sauerstoff. De Gradient, deen dobäi opgebaut gëtt, gëtt vun der Zell benotzt, fir ATP ze produzéieren.

D'Behaaptung, datt eng Blockad ëmgaange gëtt, bedeit, datt Methylenblo Elektrone virun der Blockad ophëlt an hannert hir ofgëtt. Den oxidéierte Faarfstoff hëlt Elektrone vun NADH oder vu fréie Bestanddeeler vun der Ketten op a gëtt dobäi zu Leukomethylenblo. Déi reduzéiert Form gëtt se un Cytochrom c oder zréck an d'Ketten of. Wann d'Iwwergab hannert der Blockad geschitt, erhuelen sech d'Atmung an d'Membranpotential deelweis. Wann se un der Blockad oder virdru geschitt, erhëlt sech näischt.

Een Detail vum Komplex III ass fir e groussen Deel vun dësem Sträit entscheedend. De Komplex bedreift e Q-Zyklus mat zwou Bindungsplaze fir Inhibitoren. Antimycin bind un d'Qi-Plaz. Myxothiazol bind un d'Qo-Plaz. Eng Studie, déi nëmmen ee vun hinne benotzt, huet nëmmen d'Hallschent vum Komplex getest.

Éischt Studie: keng Ëmgeeung a Maisgehirmitochondrien

De Gureev a seng Kolleegen hu Mitochondrien aus dem Gehierkortex vu C57BL/6-Mais benotzt, mat Digitonin isoléiert a bei 0.1 mg Protein per ml ënnersicht. D'Substrater hunn dräi Zesummestellungen ofgedeckt: Pyruvat plus Malat mat jeeweils 5 mM, Succinat mat 10 mM zesumme mat Glutamat mat 2 mM, an L-Prolin mat 10 mM. Als Blocker goufe Rotenon mat 1 micromolar (Komplex I) an Antimycin mat 1 microgram per ml (Komplex III) benotzt. D'Faarfstoffdosisse louche bei 0.5, 1 an 2 micromolar, mat 1 micromolar als Haaptkonzentratioun. D'Methoden an d'Moosskurve stinn an der Matdeelung a FEBS Letters.

D'Ëmgoe vum Komplex I huet funktionéiert. Rotenon huet déi duerch ADP stimuléiert Atmung vu ronn 121 op ronn 2 nmol per minute per mg reduzéiert, an 1 micromolar Faarfstoff huet se nees op ronn 21 bruecht. D'Membranpotential huet sech mat Pyruvat plus Malat a mat L-Prolin erholl.

D'Ëmgoe vum Komplex III huet net funktionéiert. Antimycin huet d'Atmung op ronn 16 reduzéiert, an de Faarfstoff huet se nëmmen op ronn 20 erhéicht. D'Membranpotential huet sech bei kengem Substrat erholl, och net bei Faarfstoffdosisse bis zu 5 micromolar. D'Peroxiddonnéeën hunn an déiselwecht Richtung gewisen: de Faarfstoff eleng huet d'Peroxidfräisetzung vun engem Basalwäert bei 76 pmol per minute per mg op ongeféier 1170, 1460 an 1945 bei den dräi Dosissen erhéicht. Antimycin huet dëst duerch de Faarfstoff ausgeléiste Signal awer ëm ronn 25, 88 respektiv 96 Prozent reduzéiert. Wann de reduzéierte Faarfstoff direkt mam Sauerstoff reagéiert hätt, dierft d'Blockéiere vum Komplex III d'Signal net ënnerdrécken. D'Auteuren hunn doraus ofgeleet, datt de reduzéierte Faarfstoff un der Qo-Plaz vum Komplex III oxidéiert gëtt, virun der Antimycinblockad. Déi kuerz Schleef a Wierder: vun den Donateuren un de Faarfstoff, vum Faarfstoff un Qo, an duerno iwwer den normale Wee weider. Rotenon gëtt ëmgaangen. Antimycin net.

Zweet Studie: deelweis Ëmgeeung bei dräi Aarten, un deenen zwou Inhibitorbindungsplazen

De Svab a seng Kolleegen hunn de Versuchsopbau erweidert. Si hu Gehirmitochondrie vu Mais, Raten a Meerschwäin benotzt, mat Percoll isoléiert a bei deene selwechten 0.1 mg per ml ënnersicht, mat Pyruvat plus Malat oder Glutamat plus Malat mat jeeweils 5 mM. Si hunn zwee Blocker vum Komplex III benotzt: Antimycin A mat 0.3 micromolar a Myxothiazol mat 1 micromolar. De Faarfstoff louch an de meeschten Tester bei 2 micromolar, bei den Ënnersichunge mam Cytochrom c bei 0.5. All dräi Aarte mat ofgestëmmte Protokoller sinn am fräi zougänglechen Artikel beschriwwen.

Béid Blockade goufen deelweis ëmgaangen, bei allen dräi Aarten. A Maismitochondrien huet Antimycin d'Atmung ënnerdréckt, an de Faarfstoff huet se ëm ronn 60 Prozent erhéicht, vun ongeféier 37 op 59 nmol per minute per mg. Myxothiazol huet se ëm 88 Prozent ënnerdréckt, op ronn 4.5, an de Faarfstoff huet se op dat Fënneffacht erhéicht, op ronn 23. D'Membranpotential huet sech ënner béiden Inhibitoren deelweis repolariséiert. Et gouf mat zwee Faarfstoffer gemooss (Safranin O a ratiometreschem TMRM), fir optesch Artefakter auszeschléissen.

Dësen Artikel huet och d'Iwwergab direkt getest, wat déi éischt Studie ni gemaach hat. Exogeent acetyléiert Cytochrom c mat 25 micromolar gouf vun energetiséierte Mitochondrien net reduzéiert, weder mat nach ouni Inhibitoren. D'Zouginn vum Faarfstoff huet awer a béide Fäll d'Reduktioun ausgeléist. An engem zellfräie Puffer huet NADH zesumme mam Faarfstoff Cytochrom c mat enger Vitesse reduzéiert, déi proportional zu NADH war. Dee méi laange Sprong a Wierder: Reduktiounsequivalenter un de Faarfstoff, vum Faarfstoff direkt un Cytochrom c, iwwer Komplex IV un de Sauerstoff. Dëse Wee léisst Komplex III komplett aus, soudatt béid Blocker ëmgaange kënne ginn.

Zwee zousätzlech Moosswäerter ënnerstëtzen dës Interpretatioun. D'NAD(P)H-Fluoreszenz ass erofgaangen, wann de Faarfstoff zu Mitochondrien dobäikoum, déi mat Myxothiazol behandelt waren. Dat bedeit, datt Reduktiounsequivalenter iwwer den neie Wee ofgefloss sinn. Ausserdeem huet d'Absorbanz vum Faarfstoff bei 660 nm all Zousaz noenee nogezeechent. Zentrifugéiert Iwwerstänn hu gewisen, datt den oxidéierte Faarfstoff sech bannent energetiséierte Mitochondrien op méi wéi dat Honnertfacht ugeräichert huet an duerno nees erauskomm ass, wéi d'Potential zesummegebrach ass. Och d'Protonebilanz passt: wann d'Pompelschrëtt iwwerspronge ginn, bleiwen ongeféier 2 Protone pro Elektronepuer amplaz vun 10. E méi séiere Sauerstoffverbrauch mat nëmmen deelweiser Repolarisatioun ass also dat, wat een bei enger tatsächlecher Ëmgeeung erwaart, an net e Beweis dergéint.

Déiselwecht Preparatioun huet Reaktioune gewisen, déi bei enger iwwerflächlecher Liesung zu falsche Schlussfolgerunge féieren. Mam Inhibitor plus Faarfstoff huet ADP d'Atmung reduzéiert amplaz se ze erhéijen, an eng Transportblockad huet se stimuléiert amplaz se ze bremsen. Dobäi huet d'Membranpotential sech weiderhin an déi normal Richtunge verännert. De Sauerstoffverbrauch eleng féiert an dësem System an d'Ier.

Drëtt Studie: d'Liewerstudie, déi d'Komplexer I an II getest huet, net III

De Lee an de Boelsterli hu Maisliewermitochondrien a kultivéiert Hepatozyte benotzt, déi duerch Efavirenz (Komplex I, IC50 bei 30 micromolar) an Hydrazin, de Metabolitt vun Isoniazid (Komplex II, IC50 bei 30 micromolar), geschiedegt waren. De Faarfstoff mat ronn 30 micromolar huet d'NADH-Oxidatioun, d'Membranpotential an ATP restauréiert an dobäi d'Oxidanten an den nekroteschen Zelldoud reduzéiert. Den Artikel a Redox Biology stellt dëst an engem Modell duer, an deem de Faarfstoff Elektrone laanscht déi geschiedegt Komplexer I an II transportéiert.

Dat Resultat liwwert gekläerte Kontext fir déi virgelagert Schrëtt a seet näischt iwwer Komplex III, well an där Studie do näischt blockéiert gouf. Et kann keng vun deenen zwou Gehirstudie bestätegen oder widderleeën.

D'Matrix vun de Versuchsbedéngungen

Véier Grënn, firwat béid Studie vum Komplex III fir hiren eegene Versuchsopbau richteg kënne sinn

1. De Blocker war net dee selwechten Agrëff. Antimycin eleng mat 1 microgram per ml géintiwwer Antimycin mat 0.3 micromolar plus engem separate Blocker vun der Qo-Plaz. E Faarfstoffwee, deen d'Qo-Plaz versuergt, scheitert genee do, wou en direkte Wee un Cytochrom c funktionéiert. Eng Plaz kann net fir déi zwou stoen.

2. D'Faarfstoffdosis an den Zäitpunkt waren ënnerschiddlech. Haaptkonzentratioune vun 1 géintiwwer 2 micromolar, bei engem Redoxcycler, deem seng Opnam an direkt Reduktioun vu Cytochrom c vun der Konzentratioun an der Zäit ofhänken. Kleng Dosisënnerscheeder zesumme mat ënnerschiddleche Moosszäitpunkte kënne verschidde Weeër vun engem eenzegen Netzwierk siichtbar maachen.

3. D'Preparatioune waren ënnerschiddlech. Isolatioun mat Digitonin géintiwwer Isolatioun mat engem Percoll-Gradient wielt mitochondrial Populatiounen aus, déi sech iwwerschneiden, awer net identesch sinn. D'Proteinkonzentratioun war mat 0.1 mg per ml d'selwecht, soudatt dës Variabel ewechfält, awer d'Subpopulatioun an d'Integritéit net. An den Ënnerscheed tëscht den Aarte konnt als Erklärung ausgeschloss ginn: déi zweet Grupp huet hire Phenotyp och bei Mais reproduzéiert.

4. De Substratzoustand bestëmmt, wat de Faarfstoff maache kann. Dräi Substratzesummestellunge géintiwwer NADH-gekoppelte Puer. D'NADH-Versuergung an d'Membranpotential bestëmmen zesummen, wéi séier de Faarfstoff reduzéiert gëtt a wou en sech verdeelt. E Wee, dee reduzéierte Faarfstoff nieft oxidéiertem Cytochrom c brauch, hänkt vun där Wiel of.

Wéi een déi nächst Behaaptung iwwer eng Ëmgeeung liest

Frot, wéi ee Komplex blockéiert gouf, mat wéi engem Inhibitor, op wéi enger Plaz a mat wéi enger Dosis. Frot no der Faarfstoffkonzentratioun an dem Zäitpunkt vun der Miessung. Frot no Geweebe, Aart, Isolatioun, Proteinkonzentratioun a Substrat. A frot, ob Potential, Atmung, Redoxzoustand an en direkten Iwwergabtest mateneen iwwereneestëmmen, well de Sauerstoffverbrauch eleng hei méi wéi eng Kéier an déi falsch Richtung gewisen huet.

Déi enk gefaasst Zesummefaassung bleift gülteg. Iwwer d'Ëmgoe vum Komplex I duerch de Faarfstoff besteet Eenegkeet. Beim Komplex III weisen Maismitochondrien mat Antimycin bei 1 microgram per ml a Faarfstoff bei 1 micromolar keng funktionell Ëmgeeung. Dogéint weisen dräi Aarte mat Antimycin bei 0.3 micromolar oder Myxothiazol bei 1 micromolar a Faarfstoff bei 2 micromolar eng deelweis Ëmgeeung mat direkter Iwwerdroung vum Faarfstoff un Cytochrom c. Déi Aussoe kënnen niewentenee bestoen. Alles, wat doriwwer erausgeet, ass Extrapolatioun.

Weider Lektür hält déi ëmstridde Behaaptung am Kader vun der onëmstriddener Chimie: wéi Methylenblo Elektrone weidergëtt fir d'Iwwerdroungsketten, d'Versich zum Ëmgoe vum Komplex I fir de gekläerte virgelagerte Fall, Miessunge vum Membranpotential an hir Artefakter fir d'Fro, firwat zwee Faarfstoffer néideg waren, an den Ëmgang mat Redoxcycler am Laboratoire fir d'Fale bei der Doséierung an der zäitlecher Ofstëmmung.