Alternativen zu Methylenblo fir d'Mikroskopie

Fir en einfache bakterielle Ausstréch kann Kristallviolett Methylenblo ersetzen, wann d'Zil ass, d'Form vun den Zellen ze gesinn. Fir lieweg Zelle kann Phasenkontrast ganz ouni Faarfstoff déi besser Alternativ sinn. D'Wiel hänkt dovun of, wéi eng Observatioun Dir maache musst.

Stellt Iech vir, zwou Persounen ënnersichen déi selwecht Bakteriekultur. Déi eng wëll Staangforme vu ronnen Zellen ënnerscheeden. Déi aner wëll wëssen, ob eng Behandlung d'Bakterien ofgedréit huet. E Faarfstoff, deen der éischter Persoun e kloert Bild gëtt, kann der zweeter keng benotzbar Äntwert liwweren.

Ier Dir en Ersatz auswielt, vervollstännegt dëse Saz: „Ech muss ___ an ___ observéieren, an d'Zelle mussen / mussen net um Liewe bleiwen.“ Dëse Saz definéiert d'Aufgab, déi de Faarfstoff erfëlle muss.

Fänkt mat der Prouf an der Fro un

Entscheet als éischt, ob d'Zellen um Liewe bleiwe mussen, an identifizéiert dann déi Eegenschaft, déi Dir observéiere musst:

D'Zelle mussen um Liewe bleiwen: fir Beweegung oder Form kënnt Dir ongefierfte Phasenkontrast oder DIC berücksichtegen; fir nuklear DNA Hoechst 33342 mat Fluoreszenz; fir d'Integritéit vun der Membran eng validéiert Analys wéi SYTO 9 mat Propidiumiodid.
D'Zelle mussen net um Liewe bleiwen: fir bakteriell Morphologie kënnt Dir eng einfach Kristallviolett-Fierwung oder eng negativ Nigrosin-Fierwung berücksichtegen; fir d'Gram-Reaktioun benotzt déi komplett Gram-Fierwungsmethod; fir nuklear DNA a fixéierten Zellen kënnt Dir DAPI-Fluoreszenz berücksichtegen.

Benotzt dës Tabell, fir d'Aschränkunge vun all Optioun ze vergläichen. Dëst si Wielméiglechkeete fir Methoden, keng Instruktioune fir Fläschen an engem bestoende Protokoll auszetauschen.

| --- | --- | --- | --- |

| Form an Uerdnung vu Bakterien | Preparéierte bakterielle Ausstréch; Hellfeld | Einfach Kristallviolett-Fierwung | Weist d'Morphologie; stellt weder d'Gram-Reaktioun nach d'Viabilitéit fest. |

| Zellkonturen op donklem Hannergrond | Bakteriologesch Preparatioun; Hellfeld | Negativ Nigrosin-Fierwung | Preparatioun a Formuléierung si wichteg; eng ongefierft Zell ass net onbedéngt lieweg. |

| Beweegung oder Verännerungen a liewegen Zellen | Kompatibel naass Preparatioun; Phasenkontrast oder DIC | Kee Faarfstoff | Verlaangt passend Optik; Kontrast identifizéiert keng Molekül. |

Fir en einfachen Ausstréch d'Method virsiichteg ersetzen

Kristallviolett ass eng praktesch Méiglechkeet, wann d'Aufgab eng einfaarweg Vue vun der bakterieller Morphologie ass. De Bacteriological Analytical Manual vun der FDA list zwou Kristallviolett-Formuléierungen, déi fir einfach Fierwung gëeegent sinn. Benotzt eng dokumentéiert Formuléierung an hir Preparatiounsmethod; den Numm vum Faarfstoff eleng definéiert kee gebrauchsfäerdege Reagens.

Kristallviolett gëtt och bei der Gram-Fierwung benotzt, mee dat mécht aus enger einfacher Kristallviolett-Fierwung keng Gram-Fierwung. Am ASM-Protokoll fir Gram-Fierwung hänkt dat differenziellt Resultat dovun of, datt Kristallviolett, Jod, Entfierwung a Géigefierwung an enger bestëmmter Reiefolleg wierken. Wann dës Schrëtt ewechgelooss ginn, ännert sech, wat d'Bild noweise kann. Kuckt einfach Fierwung am Verglach mat Gram-Fierwung fir dësen Ënnerscheed.

Nigrosin bitt eng aner Méiglechkeet, Konturen sichtbar ze maachen: et verdonkelt den Hannergrond, wärend d'Bakterienzelle vergläichsweis hell bleiwen. An den Instruktioune vu Merck fir Nigrosin steet en nëtzlechen Detail, deen an enger allgemenger Lëscht vun Ersatzstoffer ka feelen. Déi spezifizéiert Gebrauchsformuléierung enthält Formaldehyd. Dir kënnt also net aus de Wierder „negativ Fierwung“ ofleeden, datt d'Method mat liewegen Zelle kompatibel ass, och wann d'Zelle selwer ongefierft ausgesinn. Kontrolléiert déi komplett Formuléierung an d'Preparatioun vun der Prouf.

Fir lieweg Prouwe kënnt Dir d'Optik änneren

Wann Dir wëllt observéieren, wéi Zelle sech beweegen oder deelen, kann en zousätzleche Faarfstoff d'Observatioun komplizéieren. Wéi Nikon a sengem Guide iwwer Kontrast bei transparente Prouwen erkläert, maachen de Phasenkontrast an den Differentialinterferenzkontrast, oder DIC, Prouwen duerch Ënnerscheeder an hiren opteschen Eegenschafte sichtbar. Si kënne lieweg, ongefierft Zelle weisen, virausgesat de Mikroskop huet déi néideg Komponenten.

Dës Wiel erhält eng ongefierft Preparatioun, mee si ännert déi verfügbar Informatioun. Dir kënnt eng Grenz oder eng Beweegung verfollegen, ouni ze wëssen, wéi eng Molekül de Kontrast produzéiert huet. Wann et ëm molekular Lokalisatioun geet, wielt amplaz eng passend Markéierungsmethod.

Fir nuklear DNA ënnerscheet dem Invitrogen säi Verglach vun DAPI- an Hoechst-Faarfstoffer tëscht dem übleche Gebrauch vun DAPI mat fixéierten Zellen an dem méi zellpermeabele Hoechst 33342, deen fir d'Markéierung vu liewegen Zelle bevorzugt gëtt. Béid verlaange Fluoreszenzausrüstung. Kee vun hinnen ass en direkten Ersatz fir e faarwege Hellfeld-Faarfstoff.

Behandelt d'Belaaschtung mam Faarfstoff an d'Beliichtung als experimentell Bedéngungen. Vergläicht gefierft an ongefierft Preparatiounen, wann d'Verhale vun den Zellen Är Moossgréisst ass.

Eng rout Zell ass net automatesch eng dout Zell

SYTO 9 a Propidiumiodid ginn dacks zesumme benotzt, fir d'Integritéit vun der bakterieller Membran ze bewäerten. D'BacLight-Handbuch verbënnt intakt Membrane mat grénger Fierwung a beschiedegt Membrane mat rouder Fierwung. Dës Interpretatioun muss fir déi jeeweileg Prouf validéiert ginn.

Eng Etüd vu Rosenberg a Mataarbechter aus dem Joer 2019 illustréiert de Problem. Bei 24-Stonnen-E. coli-Biofilmer op Glas a phosphatgepufferter Salzléisung hu ronn 96% vun den Zellen in situ Propidiumiodid-positiv ausgesinn. D'Auteuren hunn awer geschat, datt 82% nom Ofhuele kultivéierbar waren. Konfokal Biller hu Zelle mat gréngem Interieur ënner rout gefierftem Material gewisen, wat op extrazellulär Nukleinsaieren als Ursaach vum irreféierende Signal higedeit huet.

Dës Prozentsätz beschreiwen ënnerschiddlech Miessungen un de Preparatioune vun der Etüd, net en universelle Korrekturfaktor. Déi nëtzlech Conclusioun ass ze kontrolléieren, wat d'Signal erzeugt huet. An engem Biofilm kann en Nukleinsaier-Faarfstoff Material baussent den Zellen genee esou detektéieren ewéi bannent beschiedegten Zellen. Fir eng Conclusioun iwwer d'Viabilitéit recommandéieren d'Fuerscher ergänzend Miessungen, wéi Kultivatioun oder metabolesch Aktivitéit, a weisen dobäi drop hin, datt all Method Aschränkungen huet.

Kontrolléiert, wat d'Alternativ tatsächlech enthält

Eng alternativ Fierwungsmethod kann trotzdeem Methylenblo enthalen. Giemsa ass e Beispill: Merck beschreift säi Produkt als eng Azur-Eosin-Methylenblo-Léisung, déi ënner anerem fir Blutt- a Knochenmarkausstrécher geduecht ass. Et kann eng aner Method fir eng aner Prouf sinn, mee et erfëllt keng Ufuerderung, Methylenblo auszeschléissen.

Wann d'Ausschléisse vun enger Verbindung Deel vum Experiment ass, kontrolléiert d'Identitéit an d'Formuléierung vum Reagens, ier Dir Biller vergläicht. De Guide iwwer Methylblo, Methylenblo an änlech benannte Faarfstoffer erkläert d'Ënnerscheeder an der Benennung.

Iwwerpréift d'Ersatzmethod, ier Dir d'Resultat benotzt

Maacht fir eng nei Method e klenge Verglach mat representativen Prouwen an enger passender Kontroll. Haalt d'Mikroskopastellungen, wa méiglech, vergläichbar. Dokumentéiert d'Formuléierung vum Reagens, d'Preparatioun vun der Prouf, d'Belaaschtung an d'Bildgebungsbedéngungen, sou datt e Bild, dat besser ausgesäit, ënnersicht an net nëmme bevorzugt ka ginn.

Bewäert den Erfolleg op Basis vun der ursprénglecher Fro. Fir Morphologie kontrolléiert, ob Zellgrenzen an Uerdnung interpretéierbar bleiwen. Fir nuklear Markéierung kontrolléiert d'Signalplaz an den Hannergrond. Fir Viabilitéit verlaangt Evidenz iwwer eng visuell attraktiv Faarftrennung eraus. De méi ëmfaassende Guide iwwer Methylenblo-Fierwung a Laborapplikatiounen erkläert, wéi d'Observatioun an d'Preparatioun zesummepassen.

Wielt déi Alternativ, déi d'Moossung erhält, déi Dir braucht. Faarf ass nëmmen eng Eegenschaft vum resultéierende Bild.