Микроскопия үчүн метилен көгүнө альтернативалар

Жөнөкөй бактериялык сүртүндүдө максат клетканын формасын көрүү болсо, метилен көгүнүн ордуна кристаллдык фиолет колдонулушу мүмкүн. Тирүү клеткалар үчүн жакшыраак альтернатива такыр боёк колдонбостон фазалык контраст болушу мүмкүн. Тандоо сиз жүргүзүшүңүз керек болгон байкоого жараша болот.

Эки адам бир эле бактериялык культураны изилдеп жатат дейли. Бирөө таякча сымал клеткаларды тегерек клеткалардан айырмалоону каалайт. Экинчиси дарылоо бактерияларды өлтүргөн-өлтүрбөгөнүн билгиси келет. Биринчи адамга так сүрөт берген боёк экинчи адамга пайдалуу жооп бербей калышы мүмкүн.

Алмаштыруучу ыкманы тандоодон мурун бул сүйлөмдү толуктаңыз: “Мен ___ ичинде ___ байкашым керек, ал эми клеткалар тирүү калышы керек / тирүү калышы шарт эмес.” Бул сүйлөм боёк аткарышы керек болгон милдетти аныктайт.

Алгач үлгүдөн жана суроодон баштаңыз

Адегенде клеткалар тирүү калышы керекпи же жокпу аныктаңыз, андан кийин байкашыңыз керек болгон белгини тактаңыз:

Клеткалар тирүү калышы керек: кыймылды же форманы байкоо үчүн боёосуз фазалык контрастты же DICти карап көрүңүз; ядролук DNA үчүн флуоресценция менен Hoechst 33342 карап көрүңүз; мембрананын бүтүндүгү үчүн SYTO 9 менен propidium iodide сыяктуу валидацияланган анализди тандаңыз.
Клеткалардын тирүү калышы шарт эмес: бактериялык морфология үчүн кристаллдык-фиолет менен жөнөкөй боёону же нигрозин менен негативдүү боёону карап көрүңүз; Грам реакциясы үчүн толук Грам боюнча боёо ыкмасын колдонуңуз; фиксацияланган клеткалардагы ядролук DNA үчүн DAPI флуоресценциясын карап көрүңүз.

Ар бир багыттын чектөөлөрүн салыштыруу үчүн бул таблицаны колдонуңуз. Булар — колдонулуп жаткан протоколдун ичинде бир бөтөлкөнү экинчисине алмаштыруу боюнча көрсөтмөлөр эмес, ыкма тандоолору.

Эмнени байкашыңыз керек	Үлгү жана жабдуу	Ыктымал альтернатива	Негизги чектөө
Бактериялардын формасы жана жайгашуусу	Даярдалган бактериялык сүртүндү; жарык талаа	Кристаллдык-фиолет менен жөнөкөй боёо	Морфологияны көрсөтөт; Грам реакциясын же жашоого жөндөмдүүлүктү аныктабайт.
Караңгы фондогу клетка контурлары	Бактериологиялык препарат; жарык талаа	Нигрозин менен негативдүү боёо	Даярдоо жана курам маанилүү; боёлбогон клетка сөзсүз тирүү дегенди билдирбейт.
Грам реакциясы	Даярдалган бактериялык сүртүндү; жарык талаа	Толук Грам боюнча боёо ыкмасы	Реагенттердин толук ырааттуулугун жана контролдорду талап кылат.
Тирүү клеткалардагы кыймыл же өзгөрүүлөр	Ылайыктуу нымдуу препарат; фазалык контраст же DIC	Боёк жок	Ылайыктуу оптиканы талап кылат; контраст молекуланы аныктабайт.
Ядролук DNA	Фиксацияланган клеткалар; флуоресценция	DAPI	Ылайыктуу дүүлүктүрүү жана эмиссия чыпкаларын талап кылат.
Тирүү клеткалардагы ядролук DNA	Тирүү клеткалар; флуоресценция	Hoechst 33342	Клеткага кириши сүрөттөө шарттары зыянсыз экенин далилдебейт.
Бактериялык мембрананын бүтүндүгү	Фиксацияланбаган бактериялар; флуоресценция	SYTO 9 менен propidium iodide	Мембрананын боёлушу жашоого жөндөмдүүлүктүн кыйыр көрсөткүчү болуп саналат.

Жөнөкөй сүртүндү үчүн ыкманы этияттык менен алмаштырыңыз

Милдет бактериялык морфологияны бир түстө көрүү болгондо, кристаллдык фиолет практикалык вариант болуп саналат. FDAнын Bacteriological Analytical Manual колдонмосунда жөнөкөй боёого ылайыктуу кристаллдык-фиолеттин эки курамы көрсөтүлгөн. Документтештирилген курамды жана аны даярдоо ыкмасын колдонуңуз; боёктун аталышынын өзү эле иштөөчү реагенттин курамын аныктабайт.

Кристаллдык фиолет Грам боюнча боёодо да колдонулат, бирок бул кристаллдык-фиолет менен жөнөкөй боёону Грам боюнча боёо кылып койбойт. ASM Gram-stain протоколунда дифференциалдык натыйжа кристаллдык фиолет, йод, түссүздөндүрүү жана каршы боёонун ырааттуу иштешине көз каранды. Бул кадамдарды өткөрүп жиберүү сүрөт эмнени аныктай аларын өзгөртөт. Бул айырмачылык тууралуу жөнөкөй боёо менен Грам боюнча боёону салыштыруу материалынан караңыз.

Нигрозин контурларды көрсөтүүнүн башка жолун сунуштайт: ал фонду караңгылатат, ал эми бактериялык клеткалар салыштырмалуу ачык бойдон калат. Merckтин нигрозин боюнча нускамасында альтернативалардын жалпы тизмесинде көз жаздымда калышы мүмкүн болгон маанилүү маалымат бар. Анда көрсөтүлгөн иштөөчү курам формальдегидди камтыйт. Ошондуктан клеткалардын өзү боёлбой көрүнсө да, “негативдүү боёо” деген сөздөрдүн негизинде анын тирүү клеткаларга шайкештиги жөнүндө тыянак чыгарууга болбойт. Толук курамды жана үлгүнү даярдоо жолун текшериңиз.

Тирүү үлгүлөр үчүн оптиканы өзгөртүүнү карап көрүңүз

Эгер клеткалардын кыймылын же бөлүнүшүн байкагыңыз келсе, дагы бир боёкту кошуу байкоону татаалдаштырышы мүмкүн. Nikon тунук үлгүлөрдөгү контраст боюнча колдонмосунда түшүндүргөндөй, фазалык контраст жана дифференциалдык интерференциялык контраст, башкача айтканда DIC, үлгүлөрдү алардын оптикалык касиеттериндеги айырмачылыктар аркылуу көрүнүктүү кылат. Микроскопто керектүү компоненттер болсо, бул ыкмалар тирүү, боёлбогон клеткаларды көрсөтө алат.

Бул тандоо препаратты боёосуз сактайт, бирок алынуучу маалыматты өзгөртөт. Контрастты кайсы молекула жаратканын билбестен эле чек араны же кыймылды байкай аласыз. Эгер суроо молекуланын жайгашуусу жөнүндө болсо, анын ордуна ылайыктуу белгилөө ыкмасын тандаңыз.

Ядролук DNA үчүн Invitrogenдин DAPI жана Hoechst боёкторун салыштыруусу DAPI көбүнчө фиксацияланган клеткаларда колдонуларын, ал эми клеткага оңойураак өтүүчү Hoechst 33342 тирүү клеткаларды белгилөө үчүн артык көрүлөрүн айырмалайт. Экөө тең флуоресценциялык жабдууну талап кылат. Экөө тең түстүү жарык-талаа боёгунун түздөн-түз алмаштыруучусу эмес.

Боёктун таасирин жана жарыктандырууну эксперименттик шарттар катары караңыз. Эгер сиз өлчөп жаткан нерсе клеткалардын жүрүм-туруму болсо, боёлгон жана боёлбогон препараттарды салыштырыңыз.

Кызыл клетка автоматтык түрдө өлүк клетка дегенди билдирбейт

SYTO 9 жана propidium iodide бактериялык мембрананын бүтүндүгүн баалоо үчүн көп учурда чогуу колдонулат. BacLight колдонмосу бүтүн мембраналарды жашыл боёлуу менен, ал эми жабыркаган мембраналарды кызыл боёлуу менен байланыштырат. Бул интерпретация үлгү үчүн валидацияланышы керек.

Розенберг жана кесиптештеринин 2019-жылдагы изилдөөсү бул көйгөйдү көрсөтөт. Фосфаттык буферленген туздуу эритмедеги айнектин үстүндөгү 24 сааттык E. coli биоплёнкаларында клеткалардын болжол менен 96%ы in situ шартында propidium-iodide-позитивдүү болуп көрүнгөн. Бирок авторлор үлгү жыйналгандан кийин алардын 82%ын өстүрүүгө болот деп баалашкан. Конфокалдык сүрөттөрдө кызылга боёлгон материалдын астында ичи жашыл клеткалар көрүнүп, жаңылыш сигналга клеткадан тышкаркы нуклеин кислоталары себеп болушу мүмкүн экенин көрсөткөн.

Бул пайыздар универсалдуу оңдоо коэффициентин эмес, изилдөөдөгү препараттарда колдонулган ар башка өлчөөлөрдү сүрөттөйт. Практикалык жыйынтык — сигналды эмне жаратканын текшерүү. Биоплёнкада нуклеин кислотасын боёочу зат жабыркаган клеткалардын ичиндеги материал менен катар клеткалардын сыртындагы материалды да аныктай алат. Жашоого жөндөмдүүлүк тууралуу тыянак үчүн изилдөөчүлөр өстүрүү же метаболизмдик активдүүлүк сыяктуу кошумча өлчөөлөрдү сунушташат, ошол эле учурда алардын ар биринин өз чектөөлөрү бар экенин белгилешет.

Альтернатива чындап эмнени камтый турганын текшериңиз

Альтернативдүү боёо ыкмасынын курамында деле метилен көгү болушу мүмкүн. Giemsa — мунун бир мисалы: Merck өз продуктусун кан жана жилик чучугунун сүртүндүлөрү сыяктуу колдонмолорго арналган azure-eosin-methylene-blue эритмеси катары сүрөттөйт. Бул башка үлгү үчүн башка ыкма болушу мүмкүн, бирок метилен көгүн толугу менен алып салуу талабын аткарбайт.

Эгер белгилүү бир кошулманы алып салуу эксперименттин бир бөлүгү болсо, сүрөттөрдү салыштыруудан мурун реагенттин идентификациясын жана курамын текшериңиз. Methyl blue, methylene blue жана окшош аталыштагы боёктор боюнча колдонмо аталыштардагы айырмачылыктарды түшүндүрөт.

Натыйжаны колдонуудан мурун алмаштырууну текшериңиз

Жаңы ыкма үчүн өкүлчүлүктүү үлгүлөрдү жана ылайыктуу контролду колдонуп чакан салыштыруу жүргүзүңүз. Мүмкүн болгон жерлерде микроскоптун жөндөөлөрүн салыштырууга ылайыктуу кармаңыз. Жакшыраак көрүнгөн сүрөттү жөн гана артык көрүп койбостон, эмне үчүн жакшыраак болгонун изилдөөгө мүмкүн болушу үчүн реагенттин курамын, үлгүнү даярдоону, таасир этүү шарттарын жана сүрөттөө шарттарын каттаңыз.

Ийгиликти баштапкы суроого карата баалаңыз. Морфология үчүн клетканын чек аралары жана жайгашуусу түшүнүктүү бойдон калганын баалаңыз. Ядролук белгилөө үчүн сигналдын жайгашуусун жана фонду баалаңыз. Жашоого жөндөмдүүлүк үчүн түстөрдүн жагымдуу бөлүнүшүнөн тышкары далил талап кылыңыз. Метилен көгү менен боёо жана лабораториялык колдонмолор боюнча кеңири колдонмо байкоо менен препаратты даярдоо кандайча өз ара байланышарын түшүндүрөт.

Сизге керектүү өлчөөнү сактаган альтернативаны тандаңыз. Түс — алынган сүрөттүн касиеттеринин бирөө гана.