Метилен көгү митохондриялык III комплексти айланып өтө алабы? Изилдөөлөр эмне үчүн ар башка жыйынтыкка келген

Эки лаборатория метилен көгү бөгөттөлгөн митохондриялык III комплексти айланып өтө алабы деген суроону изилдеген. Бирөө жок деп жооп берген. Экинчиси ооба деген. Экөөндө тең маалыматтар болгон.

Чычкандын мээсинин митохондрияларында жүргүзүлгөн биринчи изилдөө боёк муну жасай албай турганын көрсөткөн. Кемирүүчүлөрдүн үч түрүнүн мээсинин митохондрияларында жүргүзүлгөн экинчи изилдөө ал муну жарым-жартылай жасай аларын тапкан. Чычкандын боорунда жүргүзүлгөн үчүнчү изилдөө көбүнчө ушулардын катарында айтылат, бирок анда башка нерсе текшерилген. Аны өз ордуна койсоңуз, түшүнбөстүктүн жарымы жоюлат.

Бул жерде жалпыга бирдей механизм бар деп жарыялоого болбойт. Бөгөттөгүчтөрү, дозалары жана өлчөнгөн көрсөткүчтөрү ар башка үч тажрыйба бар. Адегенде шарттарды окуңуз. Корутундулар ошондон чыгат.

Бул жерде айланып өтүү эмнени билдирет

Электрондор чынжырга I комплекс аркылуу (NADHтан) же II комплекс аркылуу (сукцинаттан) кирип, III комплекс аркылуу цитохром cге, андан соң IV комплекс аркылуу кычкылтекке өтөт. Ушул жолдо түзүлгөн градиентти клетка ATP өндүрүү үчүн пайдаланат.

Айланып өтүү жөнүндөгү ырастоо метилен көгү электрондорду бөгөттөн мурун кабыл алып, бөгөттөн кийин өткөрүп берет дегенди билдирет. Кычкылданган боёк NADHтан же чынжырдын баштапкы компоненттеринен электрондорду алып, лейкометилен көгүнө айланат; анын калыбына келген формасы аларды цитохром cге же кайра чынжырга өткөрөт. Эгер электрондор бөгөттөн кийинки бөлүккө өткөрүлсө, дем алуу жана мембрана потенциалы жарым-жартылай калыбына келет. Эгер алар бөгөттөлгөн жерге же ага чейинки бөлүккө өткөрүлсө, эч нерсе калыбына келбейт.

III комплекстин бир өзгөчөлүгү бул талаштын көп бөлүгүн аныктайт. Комплекс ингибиторлор байланыша турган эки участкасы бар Q цикли аркылуу иштейт. Антимицин Qi участкасына байланышат. Миксотиазол Qo участкасына байланышат. Алардын бирин гана колдонгон изилдөө комплекстин жарымын гана текшерген болот.

Биринчи изилдөө: чычкандын мээсинин митохондрияларында айланып өтүү болгон эмес

Gureev жана кесиптештери C57BL/6 чычкандарынын мээ кыртышынан дигитонин менен бөлүнүп алынган митохондрияларды колдонуп, ар бир ml үчүн 0.1 mg белок концентрациясында текшеришкен. Субстраттардын үч режими колдонулган: ар бири 5 mM болгон пируват менен малат; 2 mM глутамат кошулган 10 mM сукцинат; жана 10 mM L-пролин. Бөгөттөгүчтөр катары 1 micromolar ротенон (I комплекс) жана ар бир ml үчүн 1 microgram антимицин (III комплекс) колдонулган. Боёктун дозалары 0.5, 1 жана 2 micromolar болгон, негизги концентрациясы 1 micromolar болгон. Ыкмалар жана катталган ийри сызыктар FEBS Letters басылмасындагы кыска билдирүүдө берилген.

I комплексти айланып өтүү иштеген. Ротенон ADP менен стимулданган дем алууну мүнөтүнө ар бир mg үчүн болжол менен 121 nmolдон болжол менен 2 nmolго чейин азайткан, ал эми 1 micromolar боёк аны болжол менен 21ге чейин калыбына келтирген. Пируват менен малатта жана L-пролинде мембрана потенциалы калыбына келген.

III комплексти айланып өтүү иштеген эмес. Антимицин дем алууну болжол менен 16га чейин азайткан, ал эми боёк аны болжол менен 20га гана көтөргөн. Боёктун дозасы 5 micromolarга чейин жеткенде да эч бир субстратта мембрана потенциалы калыбына келген эмес. Пероксид боюнча маалыматтар да ушуну көрсөткөн: боёктун өзү пероксиддин бөлүнүшүн мүнөтүнө ар бир mg үчүн болжол менен 76 pmol болгон баштапкы деңгээлден үч дозада тиешелүүлүгүнө жараша болжол менен 1170, 1460 жана 1945ке чейин көбөйткөн, бирок антимицин боёк шарттаган бул сигналды тиешелүүлүгүнө жараша болжол менен 25, 88 жана 96 пайызга азайткан. Эгер калыбына келген боёк кычкылтек менен түздөн-түз реакцияга кирсе, III комплексти бөгөттөө сигналды басаңдатпашы керек эле. Авторлор калыбына келген боёк антимицин бөгөтүнөн мурун, III комплекстин Qo участкасында кычкылданат деген тыянакка келишкен. Кыска циклди сөз менен айтканда: донорлордон боёкко, боёктон Qoго, андан ары кадимки жол менен. Ротенон бөгөтү айланып өтүлөт. Антимицин бөгөтү айланып өтүлбөйт.

Экинчи изилдөө: үч түрдө, ингибиторлордун эки участкасында тең жарым-жартылай айланып өтүү

Svab жана кесиптештери тажрыйбанын схемасын кеңейтишкен. Чычкандын, келемиштин жана деңиз чочкосунун мээсинен Percoll аркылуу бөлүнүп алынган митохондриялар ошол эле ар бир ml үчүн 0.1 mg концентрациясында, ар бири 5 mM болгон пируват менен малатта же глутамат менен малатта текшерилген. Алар III комплекстин эки бөгөттөгүчүн колдонушкан: 0.3 micromolar антимицин A жана 1 micromolar миксотиазол. Көпчүлүк текшерүүлөрдө боёк 2 micromolar, цитохром c менен жүргүзүлгөн иштерде 0.5 болгон. Бирдей протоколдор менен текшерилген үч түрдүн тең маалыматтары ачык жеткиликтүү макалада берилген.

Үч түрдүн баарында эки бөгөт тең жарым-жартылай айланып өтүлгөн. Чычкандын митохондрияларында антимицин дем алууну басаңдаткан, ал эми боёк аны болжол менен 60 пайызга, мүнөтүнө ар бир mg үчүн болжол менен 37 nmolдон 59 nmolго чейин көтөргөн. Миксотиазол аны 88 пайызга азайтып, болжол менен 4.5ке түшүргөн, ал эми боёк беш эсе көтөрүп, болжол менен 23кө жеткирген. Эки ингибитордун кайсынысы болбосун колдонулганда мембрана потенциалы жарым-жартылай кайра поляризацияланган; оптикалык артефакттарды четтетүү үчүн ал эки боёк менен (сафранин O жана катыштык TMRM) өлчөнгөн.

Бул макалада электрондордун өткөрүлүшү түздөн-түз да текшерилген; биринчи изилдөөдө мындай текшерүү болгон эмес. Сырттан кошулган 25 micromolar ацетилденген цитохром c ингибиторлор барда да, жокто да энергияланган митохондриялар тарабынан калыбына келтирилген эмес, бирок боёк кошулганда эки учурда тең калыбына келүү башталган. Клеткасыз буферде NADH менен боёк цитохром cни NADHка пропорционалдуу ылдамдыкта калыбына келтирген. Узагыраак өтүү жолун сөз менен айтканда: калыбына келтирүүчү эквиваленттерден боёкко, боёктон түздөн-түз цитохром cге, IV комплекстен кычкылтекке. Бул жол III комплексти толугу менен өткөрүп кетет, демек эки бөгөттөгүчтү тең айланып өтүүгө болот.

Эки кошумча көрсөткүч бул чечмелөөнү колдойт. Миксотиазол менен иштетилген митохондрияларга боёк кошулганда NAD(P)H флуоресценциясы төмөндөгөн, бул калыбына келтирүүчү эквиваленттер жаңы жол аркылуу сарпталганын билдирет. Ошондой эле боёктун 660 nmдеги жарык жутуусу ар бир кошуудан кийин кезеги менен өзгөргөн; центрифугалоодон алынган супернатанттар кычкылданган боёктун энергияланган митохондриялардын ичинде жүз эседен ашык топтолуп, потенциал жоголгондо кайра чыгып кеткенин көрсөткөн. Протондук баланс да буга шайкеш келет: протондор айдалган баскычтарды өткөрүп кетүүдө ар бир электрон жупка 10дун ордуна болжол менен 2 протон туура келет. Демек, кычкылтектин тезирээк колдонулушу менен бирге жарым-жартылай гана кайра поляризациялануу — чыныгы айланып өтүүнүн белгиси, ага каршы далил эмес.

Ошол эле препараттан алынган жооптор үстүртөн чечмелөөгө жол бербейт. Ингибитор менен боёк бирге болгондо ADP дем алууну көбөйтүүнүн ордуна азайткан, ал эми ташууну бөгөттөө аны жайлатуунун ордуна стимулдаган; ошол эле учурда мембрана потенциалы кадимки багыттарда өзгөргөн. Бул системада кычкылтек керектөөнү гана өлчөө жаңылыштырат.

Үчүнчү изилдөө: III эмес, I жана II комплекстерди текшерген боор изилдөөсү

Lee жана Boelsterli чычкандын боорунун митохондрияларын жана эфавиренз (I комплекс, IC50 болжол менен 30 micromolar) менен изониазиддин метаболити болгон гидразин (II комплекс, IC50 болжол менен 30 micromolar) жабыркаткан культурадагы гепатоциттерди колдонушкан. Болжол менен 30 micromolar боёк NADHтын кычкылдануусун, мембрана потенциалын жана ATPни калыбына келтирип, ошол эле учурда кычкылдандыруучуларды жана некроздук өлүмдү азайткан. Redox Biology макаласында бул боёктун электрондорду жабыркаган I жана II комплекстерди айланып ташуусу катары моделденген.

Бул натыйжа чынжырдын мурунку бөлүгү боюнча аныкталган контекст болуп саналат. Ал III комплекс жөнүндө эч нерсе айтпайт, анткени ал жерде эч нерсе бөгөттөлгөн эмес. Ал мээ боюнча жүргүзүлгөн эки изилдөөнүн бирин да тастыктай же төгүндөй албайт.

Шарттардын матрицасы

III комплекс боюнча эки изилдөө тең өз шарттарында туура болушунун төрт себеби

1. Бөгөттөгүч менен таасир этүү бирдей болгон эмес. Бир жагында ар бир ml үчүн 1 microgram антимицин гана, экинчи жагында 0.3 micromolar антимицин жана өзүнчө Qo участкасынын бөгөттөгүчү колдонулган. Боёк электрондорду Qo участкасына берген жол түздөн-түз цитохром cге өткөргөн жол иштеген жерде так иштебей калат. Бир участка экөөнүн тең ордун баса албайт.

2. Боёктун дозасы жана убакыт айырмаланган. Негизги концентрациялар 1 жана 2 micromolar болгон; бул кычкылдануу-калыбына келүү циклине катышуучу заттын сиңиши жана цитохром cни түздөн-түз калыбына келтириши концентрацияга жана убакытка көз каранды. Дозалардын кичине айырмасы менен өлчөө убактысынын айырмасы бир тармактын ар башка бутактарын ачып көрсөтүшү мүмкүн.

3. Препараттар айырмаланган. Дигитонин менен бөлүп алуу жана Percoll градиенти аркылуу бөлүп алуу митохондриялардын бири-бирине дал келген, бирок толук бирдей эмес топторун тандайт. Белок концентрациясы экөөндө тең ар бир ml үчүн 0.1 mg болгондуктан, бул өзгөрмө эсептен чыгат, бирок кичи топтор менен бүтүндүк эсептен чыкпайт. Түргө байланыштуу шек да жоюлган: экинчи топ өз фенотипин чычканда да кайталаган.

4. Субстраттык абал боёктун эмне кыла аларын аныктайт. Бир жагында үч субстраттык режим, экинчи жагында NADH менен байланышкан жуптар болгон. NADHтын камсыз болушу жана мембрана потенциалы биргелешип боёктун канчалык тез калыбына келерин жана кайда бөлүштүрүлөрүн аныктайт. Ал эми кычкылданган цитохром cнин жанында калыбына келген боёкту талап кылган жол ушул тандоого көз каранды.

Кийинки айланып өтүү жөнүндөгү ырастоону кантип окуу керек

Кайсы комплекс, кайсы ингибитор менен, кайсы участкада жана кандай дозада бөгөттөлгөнүн сураңыз. Боёктун концентрациясын жана көрсөткүч качан өлчөнгөнүн сураңыз. Тканын, түрдү, бөлүп алуу ыкмасын, белок концентрациясын жана субстратты сураңыз. Ошондой эле потенциал, дем алуу, кычкылдануу-калыбына келүү абалы жана электрондордун түздөн-түз өткөрүлүшүн текшерүү бири-бирине шайкеш келеби деп сураңыз, анткени бул жерде кычкылтек керектөөнүн өзү бир нече жолу туура эмес багыт көрсөткөн.

Так чектелген жыйынтык күчүндө калат. Боёктун I комплексти айланып өтүшү боюнча пикир бирдей. III комплекс боюнча болсо, ар бир ml үчүн 1 microgram антимицин жана 1 micromolar боёк колдонулган чычкандын митохондрияларында функционалдык айланып өтүү байкалбайт. Ал эми 0.3 micromolar антимицин же 1 micromolar миксотиазол жана 2 micromolar боёк колдонулган үч түрдө боёктон цитохром cге түздөн-түз өткөрүү менен коштолгон жарым-жартылай айланып өтүү байкалат. Бул эки билдирүү бири-бирине каршы келбейт. Мындан кеңири тыянактын баары — экстраполяция.

Тектеш материалдар талаштуу ырастоону талашсыз химиянын чегинде кармайт: электрон өткөрүү эстафетасы үчүн метилен көгү электрондорду кантип ташыйт, чынжырдын мурунку бөлүгүндөгү аныкталган көрүнүш үчүн I комплексти айланып өтүү тажрыйбалары, эмне үчүн эки боёк керек болгонун түшүнүү үчүн мембрана потенциалын өлчөө жана андагы артефакттар, ошондой эле дозалоо менен убакыт тандоодогу жаңылыштыктар үчүн кычкылдануу-калыбына келүү циклине катышуучу заттар менен лабораторияда иштөө.