Метилен көгү жана клеткалык сенесценция: фибробласт изилдөөлөрүндөгү көрсөткүчтөр

Көп кездешкен жаңылыш чечмелөө мындай болот. Макалада метилен көгү культурада өстүрүлгөн фибробласттардын популяциясына 20дан ашык кошумча эки эселенүү бергендиги айтылат. Окурман мындан ал сенесценттик клеткаларды жок кылат же адамдын өмүрүн ушундай эле өлчөмдө узартат деген тыянак чыгарат. Бул тыянак табигый сезилет. Бирок ал эки башка жагынан туура эмес.

Негизги көйгөй сандарда эмес, түшүнүктөрдө. Популяциянын эки эселениши, сенесценция маркерлери жана теломер өлчөөлөрү ар башка суроолорго жооп берет. Метилен көгү боюнча фибробласт изилдөөлөрүн лабораториялык идиштеги клетканын бир түрүндө сенесценцияга өтүүнүн кечеңдешин изилдеген жана митохондриялык өлчөөлөр менен бекемделген иш катары түшүнгөн туура. Бул мурунтан сенесценттик абалдагы клеткаларды тандалма түрдө жок кылуудан айырмаланат, ал эми организмдин картаюусу дагы өзүнчө маселе. Бул айырманын кеңири контексти митохондриялык электрон ташуу клетканын энергиясын кантип аныктай турганына жана метилен көгү тууралуу изилдөө тыянактарын кантип чечмелөө керектигине байланыштуу.

Популяциянын эки эселениши жаштыкты эмес, тарыхты эсептейт

Негизги натыйжалардын көбү IMR90 клеткаларынан алынган. Бул — адамдын түйүлдүк өпкөсүнүн кадимки фибробласттарынын, көбөйүү мүмкүнчүлүгү чектелген штаммы. Метилен көгү жана IMR90 фибробласттарынын репликативдик өмүр узактыгы боюнча алгачкы изилдөөдө культуралар белгиленген график боюнча жаңы идиштерге көчүрүлүп, культура бөлүнүүнү токтотконго чейин популяциянын жалпы эки эселенүү саны катталган. Негизинен 100 nM концентрациясынын тегерегиндеги наномолярдык деңгээлдерде метилен көгүн колдонуу культураларга бөлүнүү токтогонго чейин 20дан ашык кошумча эки эселенүүнү топтоого мүмкүндүк берген.

Популяциянын эки эселениши — эсеп жүргүзүү бирдиги. Ал популяция болжол менен канча жолу эки эселенгенин каттайт. Ал өзүнчө бир клетканын сенесценттик, тынч абалда, дифференцияланган же өлүк экенин түздөн-түз көрсөтпөйт. Клеткалар бөлүнүү жөндөмүн узагыраак сактагандыктан, стресс шартында азыраак клетка эрте бөлүнүүнү токтоткондуктан же шарттар көбөйүүчү субпопуляцияны тандап калгандыктан культура кошумча эки эселениши мүмкүн. Санактын өзү бул жолдорду айырмалай албайт.

Ошондуктан эки эселенүү санактары маркерлер менен бирге каралат. Санак көбөйүү канча убакытка созулганын көрсөтөт. Маркерлер болсо бөлүнүүнү токтоткон же тирүү калган клеткалар кандай абалга өткөнүн көрсөтөт.

Акыркы көрсөткүчтөр боюнча колдонмо: ар бир маркер эмнени билдирет

Культурадагы сенесценция — бир нече көз карандысыз өлчөөдөн аныкталган фенотип. Бир эле боёо же белок аны далилдей албайт.

ДНК синтезинин жоголушу менен коштолгон өсүүнүн токтошу. Туруктуу токтоо BrdU же EdU кошулуусунун азайышы, клеткалардын жалпак морфологиясы жана кайра себилгенден кийин өсүүнүн калыбына келбеши аркылуу текшерилет. Бул сенесценттик токтоону убактылуу тынч абалдан айырмалайт.

Сенесценция менен байланышкан бета-галактозидаза. SA-beta-gal боёосу pH 6.0 чамасындагы лизосомалык активдүүлүктү көрсөтөт. Сенесценттик фибробласттарда лизосомалардын массасы көбөйгөн сайын боёо көп учурда оң натыйжа берет. Бул спецификалык көрсөткүч эмес, ошондуктан ал көбөйүү жана молекулалык маркерлер менен бирге чечмеленет.

p16 жана p21 жолдору. p16 CDK4, CDK6 жана RB жолу аркылуу иштейт. p21 көп учурда p53 аркылуу индукцияланат. Алардын деңгээлинин жогорулашы бөлүнүүнүн токтогонун колдойт, бирок бул эки белоктун эч бири сенесценцияга гана мүнөздүү эмес.

Секретордук абал. Сенесценция менен байланышкан секретордук фенотип, же SASP, цитокиндердин, хемокиндердин, өсүү факторлорунун жана протеазалардын бөлүнүп чыгышындагы өзгөрүүлөрдү билдирет. SASP факторлорунун РНКсын же белокторун талдоо клеткалар коңшу клеткаларга кандай сигнал берерин сүрөттөйт. Алар репликативдик мүмкүнчүлүктү түздөн-түз өлчөбөйт.

Оксиданттар жана митохондриялык көрсөткүчтөр. Метилен көгү жөнүндөгү макалалар митохондриялык өлчөөлөрдү да камтыйт: IV комплекстин көлөмү жана активдүүлүгү, кычкылтек керектөө, гем синтези, мембрана массасы, мембраналык потенциал, ATP жана оксидант сигналдары. Булар бөлүнүүнүн кечеңдеп токтошу менен коштолгон метаболизмдик абалды сүрөттөйт. Алар өз алдынча сенесценцияны аныктабайт, бирок сунушталган механизмди текшерет. NAD(P)H метилен көгүн калыбына келтирип, цитохром c аны кайра кычкылданткан кычкылдануу-калыбына келүү циклинин модели ошол эле кычкылдануу-калыбына келүү циклин оксиданттардын азыраак пайда болушу менен байланыштырган IMR90 изилдөөсүндө баяндалган. Буга байланышкан дозалоо жана таралуу логикасы метилен көгүнүн фармакологиясы жана ткандарга жетүүсү темаларында каралат.

Теломерлердин кыскаруу ылдамдыгы. Туура бирдик — бир убакыт чекитиндеги узундук эмес, бир нече жума ичинде ар бир эки эселенүүдө жоголгон негиз жуптарынын саны. Жайыраак кыскаруу ар бир репликацияда азыраак кыскарууну билдирет. Бул узарууну билдирбейт; стресс IMR90 клеткаларынын бөлүнүшүн теломерлер аз өзгөргөндө да токтотушу мүмкүн.

Фибробласттарды изилдөөнүн үч схемасын салыштыруу

Бул барак үчүн даярдалган өзгөчө материал — төмөнкү салыштыруу. Ал клетканын түрүн, таасир этүү шарттарын, өлчөөлөрдү жана чектөөлөрдү бир жерге топтойт.

Изилдөө	Клеткалар жана таасир этүү шарттары	Эмне өлчөнгөн	Эмнени көрсөтө албайт
Atamna жана авторлоштор, FASEB J 2008	Кадимки IMR90 фибробласттары, наномолярдык метилен көгүнүн узак мөөнөттүү таасири, стандарттык шарт катары 100 nM	Жалпы эки эселенүү саны, IV комплекстин көлөмү, кычкылтек керектөөнүн 37 пайыздан 70 пайызга чейин өсүшү, гем синтези, суутек пероксиди же кадмий шарттаган эрте сенесценциядан куткаруу, HepG2 клеткаларындагы 2-фазанын ферменттери	Сенесценттик клеткаларды жок кылуу текшерилген эмес. Жаныбарлардын же адамдардын өмүр узактыгына байланышкан акыркы көрсөткүч жок. Бул жерде репликативдик өмүр узактыгы лабораториялык идиштеги эки эселенүүлөрдү билдирет.
Atamna жана авторлоштор, Redox Biology 2015, AMPK жана IV комплекстин биогенези боюнча кийинки механизмдик изилдөөдө баяндалган	IMR90 фибробласттары, негизинен 100 nM метилен көгү; салыштыруу үчүн AMPKны узак мөөнөттүү активдештирүүчү AICAR колдонулган	NAD менен NADH катышынын убакыт боюнча өзгөрүшү, AMPKнын убактылуу фосфорланышы, PGC-1alpha жана SURF1 индукциясы, IV комплекстин активдүүлүгүнүн 100 пайыздан ашык өсүшү, оксиданттардын 28 пайызга азайышы, теломерлердин жайыраак кыскарышы, AICAR менен болжол менен 2 кошумча эки эселенүүгө салыштырганда болжол менен 18 кошумча эки эселенүү, клеткалык циклге таасирдин жоктугу	AICAR менен салыштырууда доза болжол менен 1000 эсе жана спецификалуулугу боюнча айырмаланат, ошондуктан ал бирдей күчтү эмес, активдешүү мүнөзүн текшерет. Теломер боюнча натыйжа бир нече жума бою бөлүнүп жаткан культураларга тиешелүү.
Xiong жана авторлоштор, Aging Cell 2016, прогерия фибробласттарындагы митохондриялык жана ядролук өзгөрүүлөрдү калыбына келтирүү изилдөөсүндө берилген	Хатчинсон–Гилфорд прогериясы бар адамдардын терисинен алынган баштапкы фибробласттар жана аларга ылайыкташтырылган кадимки контролдор, көбүнчө 100 nM, 5 жумадан 12 жумага чейин	Флуоресценттик жана электрондук микроскопия менен митохондриялардын формасы, тирүү клеткаларды сүрөттөө менен кыймылдуулугу, супероксид, мембраналык потенциал, ATP, PGC-1alpha, көбөйүү жана сенесценция маркерлери, ошондой эле ядролук кабыкчанын томпоктолушу, прогериндин жайгашуусу, гетерохроматин жана гендердин экспрессиясы	Кадимки картаюунун эмес, белгилүү бир ооруга мүнөздүү эрте картаюунун модели. Морфологиянын жана маркерлердин калыбына келиши сенесценттик клеткаларды жок кылуу эмес. Жаныбарлардагы натыйжалуулук же клиникалык акыркы көрсөткүч жок.
Xue жана авторлоштор, Cells 2021 сереби, метилен көгүн картаюуга каршы талапкер кошулма катары караган серепте жыйынтыкталган	Мээнин картаюусу, нейродегенерация, тери, жарааттардын айыгышы жана прогерия боюнча адабияттарды жалпылоо	Метилен көгүн I жана III комплекстердеги электрон агымынын айрым бөлүктөрүн айланып өтө ала турган каталитикалык кычкылдануу-калыбына келүү циклинин катышуучусу катары карап, муну картаюунун эркин радикал теориялары менен салыштырат	Баяндоочу жалпылоо гана. Ал гипотезаларды иретке келтирип, клиникалык далилдер кайсы жерлерде так тыянак бербей турганын белгилейт.

Бир эле сапка караганда бардык саптардагы жалпы көрүнүш маанилүүрөөк. Төмөн дозадагы метилен көгү кайра-кайра көбөйүү мезгилинин узарышы, IV комплекстин активдүүлүгүнүн жогорулашы, оксидант сигналдарынын төмөндөшү жана морфологиянын жакшырышы менен байланышат. Изилдөөнүн схемасы убакыт боюнча байкоого негизделген бойдон калат: бөлүнүп жаткан клеткалардан баштап, көбөйүү учурунда кошулманы колдонуп, бөлүнүү канчага чейин уланарын каттоо. Мындай түзүлүш кечеңдетүү жөнүндөгү тыянакты колдой алат. Башка схема болбосо, ал жок кылуу жөнүндөгү тыянакты колдой албайт.

Сенесценцияны кечеңдетүү сенесценттик клеткаларды жок кылуу эмес

Кечеңдетүү бөлүнүп жаткан клеткалар бөлүнүүнү токтотконго чейин узагыраак бөлүнөрүн билдирет. Көбүнчө сенолитикалык таасир деп аталган жок кылуу болсо, мурунтан сенесценттик абалдагы клеткалар тандалма түрдө өлтүрүлүп же алардын саны азайтылып, жанындагы көбөйүп жаткан клеткалар тирүү каларын билдирет.

Метилен көгү боюнча фибробласт адабияты биринчи схеманы текшерет. Культуралар башында көбөйүп жаткан абалда болот, ырааттуу көчүрүп өстүрүү учурунда кошулманын таасирине дуушар болуп, бөлүнүүнү кечирээк токтотот. Ошондуктан SA-beta-gal, p16, p21 жана SASP факторлору сыяктуу маркерлер кечирээк пайда болот же белгилүү бир көчүрүп өстүрүү баскычында төмөнүрөөк деңгээлде болот. Башталыш убактысы жылганда мындай көрүнүш күтүлөт. Бул мурунтан сенесценттик абалда болгон кандайдыр бир клетканын жок кылынганын далилдебейт.

Сенолитикалык таасир жөнүндөгү тыянак үчүн башкача схема керек: адегенде культураны текшерүү менен ырасталган сенесценция абалына өткөрүү, андан кийин кошулманы колдонуу, соңунда жашоого жөндөмдүүлүктү жана клетка өлүмүн түздөн-түз өлчөп, көбөйүп жаткан контролдук клеткаларга салыштырганда ошол сенесценттик клеткалардын тандалма жоголушун көрсөтүү. Бир гана маркердин азайышы жетишсиз, анткени экспрессия клеткалар жоголбостон эле өзгөрүшү мүмкүн, ал эми калган көбөйүүчү клеткалар идишти каптап өсүп кетиши мүмкүн. Келтирилген төрт булактын бири да метилен көгү үчүн мындай тандалма азайтуу схемасын колдонбойт. Ошондуктан туура аныктама сенолитикалык таасир эмес, in vitro шартындагы сенесценцияны кечеңдетүүчү же сенесценцияга каршы активдүүлүк бойдон калат. Бул айырманын кычкылдануу стрессине байланышкан жагы клеткалар кычкылтектин реактивдүү түрлөрүн кантип көзөмөлдөй турганы тууралуу макалада кеңири түшүндүрүлөт.

Убактылуу сигнал берүү боюнча натыйжа бул айырманы дагы да айкын кылат. 2015-жылдагы IMR90 изилдөөсүндө метилен көгү NAD менен NADH катышын кыска убакытка жогорулатып, AMPKнын кыска мөөнөттүү фосфорланышын жараткан. Андан кийин IV комплекстин биогенези менен байланышкан PGC-1alpha жана SURF1 индукцияланган. AICAR менен AMPKны узак мөөнөттүү активдештирүү кошумча эки эселенүүлөр боюнча кыйла начар натыйжа берген.

Репликативдик өмүр узактыгы адамдын өмүр узактыгы эмес

Клетканын репликативдик өмүр узактыгы кычкылтек деңгээли, азык чөйрөсү жана көчүрүп өстүрүү ыргагы туруктуу болгон көзөмөлдөнгөн лабораториялык идиште бөлүнүү токтогонго чейинки эки эселенүүлөрдү эсептейт. Адамдын өмүр узактыгына ондогон жылдардагы өнүгүү, иммунитет, кан тамырлар системасы, өзөк клеткалардын нишалары, жүрүм-турум жана оорулар биригип таасир этет. Кошулма биринчисин узартып, экинчисине таасир этпеши мүмкүн; көпчүлүгүндө ушундай болот.

Прогерия фибробласттары прогеринди пайда кылган белгилүү LMNA мутациясын алып жүрөт. Аларда митохондриялар майдаланган жана кыймылдуулугу төмөн, ATP аз, ядролордун формасы бузулган жана гетерохроматин жоголгон болот. Наномолярдык метилен көгү митохондриялык көрсөткүчтөрдү жакшыртып, ядролук көрсөткүчтөрдү, анын ичинде прогериндин мембранадан бошошун, олуттуу калыбына келтирген. Бул — клетка деңгээлиндеги таасирдүү калыбына келүү. Ошентсе да бул фибробласттарда алынган натыйжа бойдон калат, ал эми авторлор жаныбарларда сыноону келечектеги иш катары белгилешкен. Оорунун бул модели прогерия жана эрте картаюу моделдериндеги метилен көгү тууралуу макалада кеңири талкууланат.

Мындан окууда колдонууга боло турган төмөнкү текшерүү тизмеси келип чыгат.

Кошулманы колдонуу бөлүнүү токтогонго чейин башталганбы же токтоо калыптангандан кийинби — ошону сураңыз. Ага чейин башталганы кечеңдетүүнү колдойт. Жок кылууну көрсөтүү үчүн токтоо калыптангандан кийин колдонуу жана тандалма өлүм тууралуу маалыматтар керек.
Контролдук топтун эки эселенүү ийри сызыгы кандай болгонун сураңыз. Жалпы эки эселенүү саны болбосо, маркерлердин өзгөрүүлөрү контексттен ажырап калат.
Жалгыз боёонун ордуна, мисалы, көбөйүү белгиси менен кошо p16 же p21 жана SA-beta-gal сыяктуу, кеминде эки класстагы маркерлерди талап кылыңыз.
Теломерлер кандайча берилгенин сураңыз. Убакыт ичинде ар бир эки эселенүүгө эсептелген ылдамдык маанилүү. Узундуктун бир жолку өлчөөсү андай мааниге ээ эмес.
Эмне туруктуу кармалганын сураңыз. Көчүрүп өстүрүүдөгү клетка тыгыздыгы, кычкылтек, азык чөйрөсүн алмаштыруу жана метилен көгүнүн жаңы же эскирген запас эритмелери фибробласттардын бөлүнүүсүнүн токтошуна таасир этет.

Ушундай окулганда, фибробласт адабияты метилен көгүнө ырааттуу, бирок чектелген роль берет: ал төмөн дозада колдонулган, кычкылдануу-калыбына келүүдө активдүү кошулма катары культурада өстүрүлгөн адам фибробласттарындагы репликативдик сенесценцияны кечеңдетип, митохондриялык көрсөткүчтөрдү жакшыртат. Механизм боюнча эң толук маалымат убактылуу энергиялык сигнал берүүгө жана IV комплекстин биогенезине тиешелүү. Бирок бул макалаларда сенесценттик клеткалардын жок кылынышы да, адамдын өмүрүнүн узарышы да көрсөтүлгөн эмес.