Метилен көгү жана ферроптоз: темир, липиддердин пероксиддик кычкылдануусу жана клетканын өлүмү

Ферроптоз — мембрананын бузулушунан болгон клетканын өлүмү. Мембраналардагы көп каныкпаган майлар чынжырлуу реакция аркылуу кычкылданат, мембрана иштен чыгат жана клетка өлөт. Бул химиялык процесс үчүн темир керек. Түшүнүктүн маңызы ушул сүйлөмдө камтылган, ал эми бул макаладагы бардык тажрыйбалар анын кайсы бир бөлүгүн текшерет.

Бул жердеги суроо кыйла тар: клеткалык тажрыйбаларда метилен көгү ошол чынжырга кандай таасир этет жана алынган натыйжа чынында эмнени көрсөтөт? Кыскача жооп мындай: эки лабораториялык изилдөөдө наномолярдык концентрациядагы метилен көгү митохондриялык липиддердин пероксиддик кычкылдануусун азайтып, башка шартта ферроптозго алып келчү түрткүлөрдөн кийин клеткаларды тирүү сактаган. Кеңири жооп маанилүүрөөк, анткени чынжырдын ар бир звеносу башка кийлигишүү менен текшерилген жана ар бир кийлигишүүнүн өз чектөөлөрү бар.

Ферроптоз бир абзацта

Көп каныкпаган май кислотасынын куйругун алып жүргөн мембраналык фосфолипиддин алсыз жери бар: андан суутек атомдорун оңой ажыратып алууга болот. Радикал алардын бирин ажыратып алгандан кийин липидге кычкылтек кошулат, липиддик пероксил радикалы пайда болот жана ал кийинки липидден суутекти ажыратып алат. Бир нерсе токтотпосо, реакция мембрана боюнча жайыла берет.

Негизги токтотуучу механизм — GPX4 деп аталган фермент. Ал глутатионду колдонуп, липиддик пероксиддерди зыянсыз липиддик спирттерге чейин калыбына келтирет. Лабораториялык түрткүлөр бул коргонууга белгилүү чекиттерден таасир этет. Эрастин xc-minus системасы аркылуу цистиндин клеткага киришин бөгөттөйт, натыйжада клеткага глутатион синтези үчүн цистеин жетишпей калат. Бутионин сульфоксимин глутатион синтезин түздөн-түз бөгөттөйт. RSL3 GPX4түн өзүн басаңдатат. Үчөө тең пероксиддердин жок кылынбай калышына алып келет, бирок ар башка баскычта таасир этет. Ошондуктан бир түрткү менен алынган натыйжаны автоматтык түрдө башкаларына жайылтууга болбойт.

Ферроптоз аны аныктаган касиеттери боюнча апоптоздон айырмаланат. Анда каспазалык каскад да, апоптоздук денечелер да жок. Дефероксамин сыяктуу темир хелаторлору жана ферростатин-1 сыяктуу радикалдарды кармоочу агенттер аны басаңдатат. Изилдөөчүлөр клетканын өлүмүн жөн гана некроз эмес, ферроптоз деп аныктоо үчүн ушул практикалык текшерүүнү колдонушат. Жөнгө салынуучу клетка өлүмүнүн жолдорун кеңири кароо бул айырманы түшүнүүгө жардам берет, ал эми клеткалардын лабилдүү темир менен кандай иштеши хелаттоо эмне үчүн ушунчалык чечүүчү контролдук текшерүү экенин түшүндүрөт.

Митохондриялардын орду жана бул эмне үчүн талаш жараткан

Алгачкы иштерде митохондриялык ДНКсы жок клеткалар да ферроптозго дуушар болору билдирилген. Бул митохондриялар милдеттүү эмес деген божомолго алып келген. Кийинки иштер митохондриялардын санын азайтуу же дем алууну бөгөттөө цистеиндин жетишсиздигинен келип чыккан ферроптозду басаңдата аларын, бирок GPX4тү түздөн-түз басаңдатуудан келип чыккан ферроптозго мындай таасир этпей турганын көрсөткөн. Эгер митохондриялардын салымы түрткүгө, клетканын түрүнө жана чечүүчү пероксиддик кычкылдануу кайсы жерде жүрөрүнө жараша болсо, эки натыйжа тең туура болушу мүмкүн.

Бул макалага негиз болгон изилдөө талаштуу маселени белгилүү бир клеткалык бөлүккө багытталган зонд аркылуу караган. MitoCLox — липиддердин пероксиддик кычкылдануусун көрсөтүүчү индикатордун митохондрияга багытталган түрү: ал митохондриянын ичиндеги липиддик пероксил радикалдарына жолукканда флуоресценциясын өзгөртөт. Эрастин менен иштетилген фибробласттарда митохондриялык зонддун кычкылдануусу клеткалар али тирүү кезде, өлүмгө чейин пайда болгон жана клеткалардын популяциясында бирдей болгон эмес. Бул убакыттык ирет маанилүү. Өлүмдөн мурда болгон пероксиддик кычкылдануу анын мүмкүн болгон себеби болушу ыктымал. Өлгөн клеткаларда гана өлчөнгөн пероксиддик кычкылдануу болсо — бузулуунун калдыгы. Липиддердин пероксиддик кычкылдануусун аныктоочу анализдер жана ар бир зонд эмнени көрсөтөрү жөнүндө кошумча колдонмодо зонддун жайгашкан жери сигналдын маанисин эмне үчүн аныктай турганы каралат.

Ушундай эле көрүнүш экинчи моделде да байкалган. Лебердин тукум куума оптикалык нейропатиясы бар бейтаптан алынган, I комплексте мутациясы жана баштапкы кычкылдануу стресси жогору болгон фибробласттар глутатион азайганда ферроптоздон өлгөн, ал эми контролдук фибробласттар туруштук берген. Митохондриялык зонддун кычкылдануусу бул жолу да биринчи пайда болгон. Толук маалымат ферроптоз учурундагы митохондриялык липиддердин пероксиддик кычкылдануусун фибробласттарда изилдеген эмгекте берилген.

Бул тажрыйбаларда метилен көгү эмнени өзгөрткөн

Метилен көгү — кычкылдануу-калыбына келүү реакцияларында электрон ташуучу зат. Анын кычкылданган формасы I комплекстеги NADH менен байланышкан реакциялардан электрондорду кабыл алат, ал эми калыбына келген формасы аларды IV комплекске электрон жеткирген цитохром cге берет. Бул чынжырдын электрондор адатта кычкылтекке өтүп, супероксид түзгөн бөлүгүн жарым-жартылай айланып өтүүчү жолду түзөт. Электрондордун өткөрүлүшүн толук түшүнгүсү келген окурмандар метилен көгү митохондриялар аркылуу электрондорду кантип жылдырарын кароодон баштаса болот.

Эрастин менен иштетилген өпкө фибробласттарында 250 наномолярдык концентрациядагы метилен көгү, митохондрияга багытталган SkQ1 жана MitoTEMPO антиоксиданттары менен катар, клетканын жашап калышын баалаган анализде жашоого жөндөмдүүлүктү сактаган. Дооматтын чегин контролдук текшерүүлөр аныктайт. Ферростатин-1, альфа-токоферол жана дефероксамин да коргогон, бул өлүмдүн ферроптоздук болгонун ырастайт. Антиоксиданттык тобу жок SkQ1 аналогу коргогон эмес. Бул таасир спецификалык эмес топтолууга эмес, кычкылдануу-калыбына келүү химиясына байланыштуу экенин көрсөтөт. SkQ1 концентрациясы болжол менен 200 наномолярдан ашканда коргоочу таасир басаңдаган. Бул хинондук антиоксиданттардын жогорку өлчөмдө белгилүү болгон прооксиданттык жүрүм-турумуна шайкеш келет. Метилен көгүнүн да дозага жараша ушундай эки жактуу таасири бар: бул лабораториялык идиштерде төмөн наномолярдык деңгээлдерде коргойт, ал эми концентрациясы жогорулатылганда же күчтүү жарык берилгенде кычкылдануу-калыбына келүү цикли аркылуу суутек пероксидин түзө алат. Дозага байланышкан мындай жагдайлар митохондриялардагы кычкылтектин реактивдүү түрлөрү жөнүндө макалада каралат.

Андан кийин бөлүп алынган митохондриялардагы тажрыйбалар ROS булактарын ажыраткан. Эки валенттүү темир бар кезде I комплекске электрон берген субстраттар менен ротенон зонддун кычкылдануусун күчөткөн. Ротенон электрон агымын флавиндик участоктон кийинки жерден бөгөттөйт, ошондуктан ага чейинки ташуучулар калыбына келген абалда калып, матрикске караган флавинден электрондор кычкылтекке өтөт. III комплекске электрон берген субстраттар менен антимицин A көп санда суутек пероксидин пайда кылган, бирок липиддердин пероксиддик кычкылдануусун шарттаган эмес. Жалпы ROS сигналы бирдей, бирок жайгашкан жери башка, натыйжасы да башка. SkQ1 менен метилен көгүнүн ар бири суутек пероксидинин түзүлүшүн басаңдатпастан, I комплекс шарттаган пероксиддик кычкылданууну басаңдаткан. Бул алардын таасири ROS пайда болгондон кийин, липиддердин пероксиддик кычкылдануу баскычында жүрөрүн көрсөтөт.

Темирдин ашыкча топтолушу боюнча багыт жана липофусцин берген белги

Экинчи изилдөө суроону темир тараптан караган. Миллимолярдан төмөн концентрациядагы үч валенттүү темирдин аммоний цитратына дуушар болгон H9c2 кардиомиоциттеринде митохондриялык ROS, андан кийин митохондриялык липиддердин пероксиддик кычкылдануусу жана ферроптоз пайда болуп, мунун артынан 24 сааттын ичинде липофусцинге окшош пигмент топтолгон. Липофусцин — жаш өткөн сайын топтолуучу, кычкылданган липиддер менен белоктордун темир камтыган автофлуоресценттүү калдыгы. Анын бул жерде тез пайда болушу темир шарттаган курч пероксиддик кычкылданууну карылыктын классикалык маркери менен байланыштырат. Наномолярдык концентрациядагы метилен көгү менен SkQ1дин ар бири пероксиддик кычкылдануунун, өлүмдүн жана пигменттин топтолушунун алдын алган. Бөлүп алынган жүрөк митохондриялары бул мыйзам ченемдүүлүктү ырастаган: ротенон менен эки валенттүү темир пероксиддик кычкылданууну жана пигментке окшош сигналды пайда кылган, ал эми эки агент тең муну бөгөттөгөн. Толук ырааттуулук H9c2 кардиомиоциттеринде темирдин ашыкча топтолушун изилдеген эмгекте баяндалган. Бул маселедеги пигментке байланышкан бөлүк липофусцин жана клеткалык картаюунун маркерлери темасына кирет.

Клетканын жашап калышын баалаган анализдер эмнени көрсөтпөйт

CellTiterBlue сыяктуу жашоого жөндөмдүүлүк көрсөткүчү түрткү жана мүмкүн болгон коргоочу зат берилгенден кийин лабораториялык идиште канча клетка метаболизмдик активдүүлүгүн сактаганын көрсөтөт. Бул — белгиленген системада механизмди текшерүү. Бул дарылоонун натыйжасы эмес. Бул тажрыйбалардын эч биринде бейтапка доза берилген эмес, оорунун жыйынтык көрсөткүчү өлчөнгөн эмес жана организмдеги терапиялык диапазон аныкталган эмес.

Төрт чектөөнү ачык айтуу зарыл. Биринчиден, клеткалардын түрлөрү аз: трансформацияланган өпкө фибробласттары, анын ичинде митохондриялык оорусу бар бир линия камтылган теринин баштапкы фибробласттары, келемиштин кардиомиоцит линиясы жана бөлүп алынган келемиш жүрөгүнүн митохондриялары. Сезгичтик линияга жараша айырмаланган, ал эми LHON линиясы изилдөө үчүн атайын тандалгандыктан өзгөчө аялуу болгон. Экинчиден, түрткүлөр лабораториялык өтө күчтүү шарттарды түзөт: ташууну же синтезди толук бөгөттөө жана эч бир ткань кыска убакытта кабылбай турган темир жүктөмдөрү. Үчүнчүдөн, концентрацияны жөн гана көбөйтүү менен адамга колдонулуучу өлчөмгө айлантууга болбойт. Өстүрүү чөйрөсүндөгү наномолярдык концентрация адам үчүн доза эмес. Лабораториялык идиш менен адамдын ортосунда метилен көгүнүн таралышы, кан менен ткандарда түссүз формасына чейин калыбына келиши, жарыктын таасири жана мембраналык потенциал сыяктуу факторлор бар. Төртүнчүдөн, зонддор өздөрү жайгашкан бөлүк жөнүндө гана маалымат берет. MitoCLoxтун кычкылдануусу митохондриялык липид радикалдары пайда болгонун көрсөтөт; бирок болжолдуу акыркы окуя болгон плазмалык мембрананын айрылышы түздөн-түз токтотулганбы же ага чейинки баскычтардагы таасир аркылуу болбой калганбы — муну көрсөтпөйт.

Демек, так айтууга боло турган тыянак мындай: бул моделдерде I комплекстен келип чыккан ROS менен темир ферроптоздон мурда жүрүүчү митохондриялык липиддердин пероксиддик кычкылдануусун шарттайт, ал эми төмөн концентрациядагы метилен көгү ушул бөлүктү үзөт. Бул бөлүктөн тышкаркы бардык тыянактар үчүн адегенде жаныбарларда, андан кийин адамдарда башка тажрыйбалар керек.