보라색 혈액 염색은 누가 개발했을까? 메틸렌블루, 말라호프스키, 로마노프스키, 김자

에오신은 빨간색이다. 메틸렌블루는 파란색이다. 둘을 섞어 말린 혈액 도말에 바르면, 도말의 일부가 보라색으로 나타난다.

모든 부분이 그런 것은 아니다. 잘 만들어진 표본에서는 백혈구의 핵이 적자색을 띠고, 말라리아 원충 내부의 염색질도 같은 색을 띤다. 반면 주변 적혈구는 분홍색, 세포질은 회청색으로 남는다. 이 보라색 덕분에 세포 유형을 서로 구별할 수 있다.

어느 병에도 보라색은 들어 있지 않다. 이 색은 메틸렌블루의 특정 분해산물이 슬라이드 위에서 에오신과 만날 때만 나타난다. 하지만 1880년대와 1890년대에는 그 물질이 무엇인지는커녕 존재한다는 사실조차 아무도 몰랐다. 이 색을 찾아 나선 이들은 불순한 염료를 다루며 각자 연구했다. 선반에 두 달 동안 놓여 있던 병 속에 무엇이 들어 있는지 확실하게 알아낼 방법도 없었다.

그래서 제목의 질문에는 근거를 댈 수 있는 답이 하나 이상 있으며, 그 답은 2011년에 달라졌다.

혼합물이 바뀔 때마다 달라진 관찰 결과

이 염색법은 단번에 발명된 것이 아니다. 여러 변화가 쌓여 만들어졌다. 혼합물을 바꿀 때마다 정확히 한 가지 새로운 정보가 눈에 들어왔고, 그 정보가 나타난 순서가 이 역사를 이해하는 가장 명확한 방법이다.

중요한 것은 마지막 열에 나타나는 흐름이다. 발전이 있을 때마다 색상 범위가 넓어졌고, 그때마다 구조 하나가 더 눈에 들어왔다. 보라색은 이 기법을 꾸미는 장식이 아니다. 원충이 있다는 사실을 보는 것과 원충이 무엇으로 이루어져 있는지 보는 것의 차이다. 염료 자체가 BASF의 염료 공장에서 의학으로 넘어간 과정에는 별도의 문헌을 갖춘 더 긴 역사가 있다. 위의 전체 과정과 각 항목의 출처는 출처가 연결된 기여자 연표에 정리되어 있다.

그림: 같은 여섯 혼합물을 용기에 들어 있던 물질과 그 결과로 나타난 색으로 표현했다. 원은 염료를, 그 아래 블록은 해당 염료가 혈액 도말에서 만들어 낼 수 있었던 색을 나타낸다. 1890년 이전에는 적자색 블록이 없고, 그 이후에는 빠짐없이 있다.

의도적으로 붕사를 사용한 사람

에른스트 말라호프스키는 오늘날 브로츠와프인 브레슬라우의 의사였다. 그는 개업 진료와 동료 한 명과 함께 운영한 작은 진료소에서 평생 일했고, 개인 시간을 내어 실험실 연구를 했다. 1857년 3월 12일 스트셸노에서 태어나 브레슬라우 대학교에서 의학을 공부했으며, 1882년부터 1887년까지 당시 독일에서 두 번째로 큰 병원이었던 올세인츠 병원에서 내과 조수로 일했다.

그는 1888년에 헹친스키와 플렌의 이중 염색법으로 연구를 시작했다. 1889년에 만든 표본에서 말라리아 원충 핵의 염색질이 세포질과 다르게 염색되는 것을 보았지만, 그 결과를 재현하지 못했다. 메틸렌블루를 산성화해 보았으나 결과는 더 나빠졌다. 붕사로 알칼리화해 보자 매번 효과가 있었다. 그는 1890년 6월 15일 이 방법을 공개 시연했고, 1891년 8월에는 붕사 사용 지침을 포함한 더 상세한 설명을 발표했다. 염색에는 24시간이 걸렸으며 결과는 쉽게 재현할 수 있다고 기록했다.

진단검사실에서 24시간은 긴 시간이며, 그의 논문은 원충 핵의 자적색을 자세히 다루지 않았다. 이유가 무엇이든, 1898년 노흐트가 다시 시도하기 전까지 메틸렌블루를 의도적으로 알칼리화하는 방법을 이어 간 사람은 없었다. 말라호프스키는 이후 혈액 염색에 관한 글을 다시 쓰지 않았다.

최근까지 그에 대해 알려진 것이 거의 없었던 이유는 미스터리라기보다 기록 보존의 문제다. 의학 문헌에는 그의 삶에 관한 흔적이 거의 남지 않았고, 남아 있는 기록은 한 경로로 전해졌다. 딸 마리는 1939년 독일을 떠나 런던으로 갔고, 영국군에서 복무한 뒤 캐나다에 정착했다. 마리가 모은 가족 문서는 결국 뉴욕의 레오 백 연구소에 보관되었다. 남동생 레오는 제1차 세계대전에서 전사했다. 여동생 에바는 1942년 4월 브레슬라우에서 이즈비차 경유 수용소로 강제 이송되었으며 돌아오지 못했다. 어머니 헤트비히는 같은 강제 이송을 기다리는 대신 1942년 4월 22일 스스로 목숨을 끊었다. 말라호프스키는 이 모든 일이 일어나기 전인 1934년에 세상을 떠났다.

그렇게 끝난 가족사는 더 이상 인용되지 않는 가족사가 된다. 말라호프스키를 이 염색법의 개발사에 다시 자리매김한 두 논문은 모두 2011년에 발표되었다. 포즈난과 브로츠와프의 기록 문서, 그리고 뉴욕에 보관된 마리의 문서를 토대로 작성되었다.

곰팡이 핀 병과 운 좋은 러시아인

드미트리 로마노프스키는 상트페테르부르크의 군사의학 아카데미에서 의학을 공부했으며, 경력의 대부분을 말라리아 연구에 쏟았다. 1890년에 발표한 방법은 문헌상으로 헹친스키의 방법과 거의 같았다. 변형하지 않은 메틸렌블루와 에오신을 사용하되 에오신을 조금 더 넣었다.

1891년 9월 그는 자신의 이름을 알리게 된 방법을 발표했다. 중요한 세부 사항은 사용 지침 속에 묻혀 있었다. 가장 좋은 결과는 die vorräthige Methylenlösung, 즉 두 달 넘게 놓아두어 곰팡이가 자란 메틸렌블루 저장 용액에서 나왔다. 곰팡이와 보관 시간으로 인해 염료는 부분적으로 탈메틸화되어 있었다. 로마노프스키는 이 사실을 몰랐고 제어할 수도 없었으며, 그의 방법을 시도한 다른 연구자들은 보라색을 얻지 못했다. 그의 학위논문은 1891년 6월 상트페테르부르크에 제출되었고, 이 때문에 일반적인 설명에서는 1891년을 발견 연도로 본다.

말라호프스키의 시연은 그보다 1년 이상 앞선 1890년 6월에 이루어졌으며, 그의 방법은 의도한 대로 작동했다.

왜 엉뚱한 사람의 이름이 붙었을까

말라호프스키의 공로를 뒷받침하는 논거는 크리스틴 크래프츠, 에른스트 헴펠만, 바르바라 올렉신이 정리했으며, 네 가지에 근거한다. 첫째는 공개 시연 날짜로, 1890년 6월과 1891년 9월을 비교한다. 둘째는 의도적이었다는 점과 우연이었다는 점의 차이다. 셋째는 말라호프스키가 붕사 사용을 포함해 방법 전체를 발표한 반면 로마노프스키의 방법은 제어되지 않은 변수에 의존했다는 사실이다. 넷째는 우연히 얻은 결과를 아무도 재현하지 못했기 때문에, 말라리아 원충의 핵에 관한 설명과 그 핵을 드러낸 보라색이 사실상 7년 동안 문헌에서 사라졌다는 점이다.

이들은 결론을 단호하게 제시한다. 전기 논문에서는 이러한 공로 부여를 “왜곡”이라고 부르며, 1978년에 “아마도 이 염색법 계열을 말라호프스키 염색이라고 불러야 할 것이다”라고 쓴 랠프 릴리의 말을 인용한다.

우선권 주장에 흔히 따르듯 이 주장에도 이견이 있다. 여기서는 논쟁을 결론짓기보다 그 구도를 설명할 가치가 있다. 우선권을 논하려면 무엇을 발견으로 볼 것인지 밝혀야 한다. 발견이 보라색 자체라면, 말라호프스키에게 더 이른 시연 기록이 있다. 발견이 발표된 방법이라면, 두 사람 모두 1891년에 발표했고 염색법에는 로마노프스키의 이름이 붙었다. 발견이 원리에 대한 설명이라면, 두 사람 모두 공로를 주장할 수 없다. 숙성이 탈메틸화라는 사실을 둘 다 몰랐고, 애초에 그 색이 왜 나타나는지도 설명할 수 없었기 때문이다. 대중적인 설명에서는 이 마지막 지점을 건너뛴다. 핵심 성분은 아무도 정체를 밝혀내지 못한 불순물이었으며, 보라색을 처음 의도적으로 만들어 낸 사람도 그 조성이 어떻게 작동하는지 이해해서가 아니라 재현 가능한 경험적 배합법으로 결과를 얻었다.

2011년의 두 논문은 말라호프스키의 공로에 대한 논거를 가장 충실하게 제시한 발표 자료이며, 둘 다 PubMed에서 무료로 읽을 수 있다. 긴 종설은 PMID 21235291, 전기 논문은 PMID 21660627에 있다. 종설의 PubMed 기록에는 그해 말 같은 학술지의 86(5):366에 실린 논평도 표시되어 있다. 이 논거가 발표 직후부터 학술 문헌에서 논쟁의 대상이 되었다는 점을 상기시켜 준다.

이 논쟁은 화학에 관한 의견 충돌은 아니다. 관련된 모든 사람은 보라색의 정체와 그 색을 만들어 내는 성분에 동의한다. 의견이 갈리는 지점은 누가 먼저 그 결과에 도달했는지, 그리고 아무도 재현하지 못한 우연을 과연 그 결과에 도달한 것으로 볼 수 있는지다.

뒤이어 등장한 이름들이 이룬 것

말라호프스키가 보라색을 처음 만들어 냈다면, 왜 염색법에는 로마노프스키, 라이트, 김자의 이름이 붙어 있을까?

개발자의 손에서 한 번 작동하는 염색 혼합물만으로는 시약이라고 할 수 없기 때문이다. 후속 연구는 다루기 까다로운 혼합물을 다른 나라의 실험실 기술자가 평범한 화요일에도 사용할 수 있는 것으로 바꾸었다.

노흐트는 추론을 통해 해답에 도달했다. 단순한 중성 염료에서 안정적인 결과를 얻지 못하자, 보라색은 메틸렌블루 용액 안에 있지만 메틸렌블루 자체는 아닌 물질에서 나와야 한다고 결론짓고 그 물질을 찾기 시작했다. 운나는 이미 오래된 메틸렌블루 용액이 비만세포 과립을 빨간색으로 염색한다는 점을 관찰했고, 염료가 숙성되면서 새로운 물질이 생긴다고 제안했다. 베른트젠은 1885년에 알칼리 조건에서 메틸렌블루의 메틸기가 제거된다는 것을 밝혔으며, 이때 생기는 산물이 오늘날 아주르 계열이라고 부르는 물질이다. 노흐트는 클로로포름으로 활성 분획을 추출했지만, 이를 Rot aus Methylenblau, 즉 메틸렌블루에서 나온 적색이라고만 부를 수 있었다. 미하엘리스는 1901년에 이를 아주르 I이라고 명명했다. 제너는 실용적인 문제를 해결했다. 메틸렌블루와 에오신의 침전물을 무수 메탄올에 다시 녹이자, 염색과 동시에 도말을 고정하는 하나의 안정적인 용액이 만들어져 열 고정이 필요 없어졌다. 리슈만과 로이터는 다색화한 염료를 알코올성 용매와 결합해 안정성과 보라색을 함께 얻었다. 라이트는 65 °C에서 12시간 배양한 뒤 열흘 동안 방치하는 과정을 흐르는 증기 속에서 한 시간 처리하는 방식으로 바꾸었다. 김자는 무작위로 숙성된 용액에 의존하는 것을 아예 그만두었다. 정체가 알려진 염료를 정량해 사용하고 메탄올에 글리세롤을 넣어, 제품이 열대의 더위에서도 견디도록 했다. 그는 순수한 메틸렌 아주르를 만드는 방법을 공개하지 않았다. 이를 라이프치히의 그뤼블러 박사 실험실에 판매했고, 그 실험실은 아주르 I이라는 이름으로 제품을 출시하면서 자신들의 제품만이 진정한 김자 염색액이라고 주장했다.

그 아주르의 정체는 여전히 논쟁거리다. 단순히 다색화한 메틸렌블루였다고 보는 이들도 있고, Azure B가 풍부한 물질이었다고 보는 이들도 있다. 답은 전쟁 속에서 나왔다. 독일산 염료를 구할 수 없게 되자 미국 공중보건국의 랠프 릴리, 모리스 로, 에이미 윌콕스 연구팀은 분리된 세 성분에서 가장 좋은 염색 결과가 나온다는 것을 발견했다. 변형되지 않은 메틸렌블루, 그 탈메틸화 분해산물인 Azure B, 그리고 에오신이었다. Azure B는 구할 수 없던 아주르 I을 대체했고, 이 세 성분은 오늘날에도 말라리아 진단에 사용하는 염색액의 기본을 이룬다.

이 세 성분이 슬라이드 위에서 어떻게 상호작용하는지에 관한 화학은 별개의 질문이며, 다른 글에서 다룬다. 로마노프스키형 염색의 염료 역할과 화학에서는 Azure B와 에오신이 각각 무엇을 하는지, 두 성분이 왜 각각으로는 만들어 내지 못하는 색을 함께 만들어 내는지 설명한다. 현미경 관찰과 실험실 활용 글은 실무적인 측면을 다룬다. 특정 표본에서 무엇이 보이는지, 그리고 특정 제품이 사용하려는 방법에 적합한지 어떻게 판단하는지를 설명한다.

지금도 유효한 역사의 한 부분

이 이야기의 한 가지 사실은 1902년 이후에도 그대로였다. 약 50년 동안 세계 표준 말라리아 염색액의 가장 중요한 성분은 이름 없는 불순물이었다. 우연히 들어 있었고, 양은 병마다 달랐으며, 그 기간의 일부 동안 정체는 영업 비밀이었다. 배합 비율에 관한 논쟁은 1940년대까지 이어졌다. 염색액을 사용하던 사람들이 부주의했던 것은 아니다. 병 안에 무엇이 들어 있는지 알 방법이 없었다.

오늘날 같은 문제는 물질의 일부만 설명하는 규격의 형태로 나타난다. USP 적합성은 시장에서 제공하는 최고 순도에 이르는 길이다. 단일 측정값이 아니라 공개된 완전한 표준이기 때문이다. 여기에는 확인시험, 순도, 아주르 염료를 포함한 유기 불순물, 잔류 용매, 원소 불순물, 강열잔분, 미생물 한도, 세균 내독소가 포함된다. Blupreme은 제약 제조업체에서 메틸렌블루를 공급받고 전체 시험성적서를 공개한다. 따라서 이 목록의 모든 항목을 단순한 주장으로 받아들이는 대신 직접 확인할 수 있다. 중금속 시험 결과만 제시하면서 USP를 준수한다고 하는 성적서는 “숙성 메틸렌블루”라는 라벨이 붙은 병의 현대판이다. 좋은 시약일 수도 있지만, 그 라벨만으로는 안에 무엇이 들어 있는지 알 수 없다.