Метилен көгі жасушаларға қалай енеді: тотықсыздану, қайта тотығу, сіңірілу

Ыдыстағы эндотелий жасушаларының метилен көгін сіңіруін бақылағанда, ең айқын көрінетін түсіндіру қате болып шығады. Орта көк түсінен айырылады, жасушаларда көк түйіршіктер пайда болады, демек бояғыш мембранадан көк молекула түрінде өткен сияқты. Алайда тәжірибелер басқа нәрсені көрсетеді. Көк түрі мембранадан өте нашар өтеді. Өтетіні — түссіз түрі, ал жасуша ішінде көрінетін көк түс сол жерде, молекула енгеннен кейін пайда болады.

Бұл кері реттілік маңызды, өйткені боялудан қандай қорытынды жасауға болатынын және болмайтынын анықтайды. Көк түйіршіктер органеллаларда қайта тотығып, ұсталып қалған тотыққан бояғышты көрсетеді. Олар жасушадағы бояғыштың жалпы мөлшерін де, тотықсызданған қорын да көрсетпейді және биологиялық әсерді өлшемейді. Мұның себебін түсіну үшін үш кезеңді қарастырайық: жасуша бетіндегі тотықсыздану, тотықсызданған түрдің диффузиясы, жасуша ішіндегі қайта тотығу және ұсталып қалу.

Екі түрі екі түрлі молекуладай әрекет етеді

Тотыққан метилен көгі — оң зарядталған жазық сақиналы жүйе. Ол суда ериді, шамамен 600–700 нанометр аралығындағы жарықты күшті жұтады және көк болып көрінеді. Мұнда шешуші нәрсе — заряд. Зарядталған, суға бейімді молекула липидтік мембранадан оңай өте алмайды, сондықтан әдебиеттегі мұқият тұжырым — «мембранадан мүлде өтпейді» емес, «мембранадан салыстырмалы түрде нашар өтеді».

Лейкометилен көгі деп аталатын тотықсызданған метилен көгі түссіз, зарядсыз және майда ериді. Заряд жойылса, мембрана бөгет болудан қалады. Тотықсызданған молекула одан оңай диффузияланады, ал тотығуға көбірек бейім жасушаішілік бөлімге түскенде, электрондарын қайта беріп, көк, зарядталған және сол жерде ұсталып қалатын түріне орала алады. Сондықтан бояғыштың тотығу-тотықсыздану химиясы оның тасымалдану механизмі де болып табылады. Электрондар саны өзгерсе, мембранадан өту қабілеті де өзгереді.

Бірінші кезеңге қажет электрондарды жасушаның өзі береді. Сүтқоректілердің жасушалары плазмалық мембрана арқылы электрондарды тасымалдап, тотықсыздандырғыш эквиваленттерді жасушаішілік донорлардан сыртқа, беткі акцепторларға жеткізеді. Плазмалық мембрана арқылы жүретін бұл белсенділік — жасушалардың көпшілігіне тән қалыпты қызмет. Тиазин бояғыштарына әсер ететін эндотелийдің беткі редуктазасы бір маңызды белгісі бойынша басқа осындай жүйелерге ұқсайды: кейінгі кезеңдерді тоқтататын дозалардағы цианид пен азидтің қатысуында да жұмысын жалғастырады. Осы кезеңдердің бір-бірінен ажырауы бүкіл түсіндірудің өзегін құрайды.

Алдымен фазалар арасында таралу зерттелді және ол сіңірілуді түсіндіруге жақын болды

1929 жылы Рокфеллер институтындағы Мариан Ирвин қарапайымырақ сұрақ қойды. Бәлкім, бояғыштың енуі оның су мен жасушаның майлы қабаттары арасында таралуы ғана болар, ал зертханада сол майлы қабаттардың орнына хлороформ қабатын қолдануға болатын шығар. Ол спектрофотометриялық ену зерттеулерінде бояғыштың сулы ерітінділерін хлороформмен шайқап, органикалық фазаға өткен мөлшерді тірі балдыр жасушаларына енген мөлшермен салыстырды.

Сол жұмыстың екі нәтижесі әлі де назар аударуға тұрарлық. Біріншіден, коммерциялық метилен көгі ерітінділерінде қазір azure B деп аталатын триметилтионин болған. Бұл қоспа метилен көгінің өзінен жылдамырақ енген, әсіресе липидте еритін бос негіз түрі басым болатын сілтілі pH жағдайында. Метилен көгінің енуі сияқты көрінген құбылыстың бір бөлігі шын мәнінде azure B-нің таңдамалы енуі болған. Екіншіден, pH иондану күйін анықтау арқылы нәтижені белгілеген, ал зақымданған жасушалар бүтін жасушаларға қарағанда әлдеқайда көп бояғыш өткізген. Жасанды жүйе мен тірі жасушаның нені сіңіретіні таралу коэффициенттері мен заряд күйіне тәуелді болған. Екеуінің ұқсастығы жасуша шекарасында сулы емес қабаттар бар деген ойды қолдаған.

Бұл модель липидтер мен ионданудың маңызын алдын ала дұрыс болжады. Бірақ ол өз күйін өзгертпей фазалар арасында таралатын бояғышты жасуша бетінде химиялық түрленіп, басқа түрде өтіп, ішінде қайта бастапқы түріне айналатын бояғыштан ажырата алмады. Бұл айырмашылықты анықтау үшін басқа тәжірибе қажет болды. Ондай тәжірибе жетпіс жылдан кейін өкпе эндотелийінде жүргізілді.

Сыртта тотықсыздану, ішінде ұсталып қалу

Меркер мен әріптестері өсірілген сиыр өкпе артериясының эндотелий жасушаларымен жұмыс істеп, үш кезеңді реттілікті ұсынды: тотыққан бояғыш жасуша бетінде өзінің түссіз липофильді түріне дейін тотықсызданады, тотықсызданған түрі ішке диффузияланады, ал жасушаішілік қайта тотығу мембранадан өтпейтін тотыққан түрді қалпына келтіріп, оның жиналуына әкеледі. Олардың тиазиндердің эндотелийге сіңірілуін зерттеуі осы реттілікті нақты кезеңдерінде үзуге тырысу арқылы тексерді.

Бірінші құрал — жасушаға ене алмайтын электрон акцепторы феррицианид болды. Беткі ферменттер жасушаның сыртында көк бояғышты түссіз түріне дейін тотықсыздандырғанда, феррицианид сол электрондарды қайта тартып алып, бояғыш мембранадан өтіп үлгермей тұрып ортадағы көк түрін қалпына келтіре алады. Феррицианид артық мөлшерде болғанда (10 микромоляр бояғышқа қарсы 50–500 микромоляр феррицианид), бояғыштың сіңірілуі дерлік тоқтаған. Феррицианид жұмсалып біткеннен кейін ғана сіңірілу қалыпты жылдамдығына оралған. Кинетика да осыны басқа қырынан көрсеткен. Феррицианид шамамен тұрақты жылдамдықпен азайған: бұл қайта айналымға түсетін медиаторды қамтамасыз ететін тұрақты беткі тотықсыздану ағынына сәйкес келеді. Ал жасушадан тыс бояғыш қоры сарқылған сайын экспоненциалды түрде азайған. Тұрақты ағын мен сарқылатын қордың қатар байқалуы феррицианид сигналы бояғыш молекулаларының ерітіндіден кетуін емес, үздіксіз тотықсыздануды көрсететінін білдіреді.

Екінші құрал мембранадан өту кезеңін толығымен алып тастады. Зерттеушілер тиазиндер тобына жататын жақын туыстас бояғыш — толуидин көгі O-ны — тотығу күйінің қайсысында да жасушаға енуге тым үлкен полиакриламид тізбегіне жалғады. Жасушалар жалғанған бояғышты сонда да тотықсыздандырды. Демек, тотықсыздану үшін жасуша ішіне ену қажет емес. Оны атқаратын жүйе жасуша бетінде орналасқан немесе сол бетпен электрлік байланысқан.

Одан кейін мақаланың атауына негіз болған ажырату анықталды. 2 миллимоляр цианид пен азид бояғыштың жиналуын қатты тежеді. Микроскоппен қарағанда, әдетте ядроны айнала орналасатын қою көк және күлгін қосындылар дерлік жоғалды. Бірақ екі тежегіштің ешқайсысы жасушадан тыс тотықсыздануды баяулатпады: феррицианидтің айналымы әлсіремей жалғасты, ал жасушаға өтпейтін полимердегі бояғыш әлі де тотықсызданды. Бөгеліс кейінгі кезеңде болды. Цианид пен азид беткі тотықсыздануды емес, жасушаішілік қайта тотығу мен оқшаулануды тоқтатты. Жасушалардың тіршілікке қабілеттілігін тексеру де бұл түсіндіруді қолдады: осы өңдеулер кезінде жасушалар цитозольдік маркер ферменті лактатдегидрогеназаны ішінде сақтап қалды. Сондықтан сіңірілудің жоғалуы жай ғана уланудан немесе мембрананың жыртылуынан болған жоқ.

Мақаладағы бір ескерту әлі де өзекті. Көк қосындылар ядроның ішінде емес, айналасында орналасқан, бұл тотығудың жасушаішілік органеллаларда жүруіне сәйкес келеді. Алайда зерттеу олардың қай органеллалар екенін анықтамады. Басқа жасуша түрлеріндегі ұқсас көріністер жеткіліксіз дәлелдерге сүйеніп лизосомалық деп аталған. Ұсталып қалуды дәлелденген құбылыс, ал оның нақты орнын әзірге болжам деп қарастырған жөн. Электрондардың одан әрі қайда өтетінін білгісі келетін оқырмандар митохондриялардағы электрон тасымалы мен тотығу-тотықсыздану үдерістері туралы және енгізу жолына қарай сіңірілу мен таралудың кеңірек көрінісі туралы оқи алады.

Боялу түскен мөлшерді көрсетпейді

Үшінші зерттеу осы сіңірілу механизмі биологиялық көрсеткішпен салыстырылғанда не болатынын көрсетеді. Скотт пен әріптестері сақина тәрізді қант торы — метил-бета-циклодекстриннің — метилен көгімен тікелей байланысатынын анықтады. Қосылу кешенінің ассоциация тұрақтысы шамамен 310 кері моляр болса, бояғыштың димерленуінікі шамамен 5846 кері моляр болған. L929 фибробласттарында бұл байланысу жасушалардың боялуын да, глюкоза сіңірілуінің ынталануын да бөгеген: циклодекстринмен алдын ала инкубациялау көк түске боялуды болдырмаған, ал оны кейін қосу бояудың кетуін жылдамдатқан. Жасушалардан оптикалық көк сигнал жоғалған сайын, белсенген глюкоза тасымалы да соған тығыз сәйкес әлсіреген.

Авторлар бұл корреляцияны ұзаққа созылатын тотығу стрессі механизмінен гөрі бояғыштың глюкоза тасымалдағышын белсендіру жолындағы бір ақуызбен тікелей әрекеттесуін қолдайтын белгі деп түсіндірді. Бұл қорытынды орынды, бірақ шектеулі. Тәжірибе ақуыздың қайсысы екенін анықтамайды, тасымалдағыштың өзімен байланысуды көрсетпейді. Бояудың кетуі мен әсердің жоғалуы арасындағы корреляция тотығу-тотықсыздану арқылы жүретін барлық ықтимал жолдарды жоққа шығара алмайды.

Негізгі тұрақты сабақ — өлшеуге қатысты. Оптикалық боялу жасушамен байланысқан, көрінетін тотыққан бояғышты көрсетеді. Ол түссіз тотықсызданған қорды мүлде байқамайды. Сондықтан бозғылт жасушада әлі де бояғыш эквиваленттері болуы мүмкін, ал қарқынды боялған жасуша тінге түскен жалпы мөлшерді немесе әсер шамасын емес, ұсталып қалған тотыққан бояғышты көрсетеді. Бұл ескерту кеңірек деңгейде де қолданылады: әртүрлі жасуша түрлерінің боялуын салыстыру немесе күңгірт тін кесіндісін көбірек мөлшер түскенінің дәлелі деп қабылдау ыдыстағы бақылаудан туған бастапқы қатені қайталайды. Сіңірілу — тотықсыздану, диффузия және қайта тотығу циклі. Көк түрдің кез келген бір сәттік көрінісі осы циклдің бір бөлігін ғана көрсетеді. Бұдан зертханалық бояу мен жұмыс істеуге және доза мен түскен мөлшер туралы мәлімдемелерді түсіндіруге қатысты практикалық салдарлар тікелей туындайды.