სტატია
როგორ შედის მეთილენის ლურჯი უჯრედებში: აღდგენა, ხელახალი დაჟანგვა და მემბრანული განაწილება
თუ დააკვირდებით, როგორ ითვისებენ მეთილენის ლურჯს ენდოთელური უჯრედები კულტურის ჭურჭელში, ყველაზე აშკარა ახსნა მცდარიც აღმოჩნდება. საკვები არე ლურჯ ფერს კარგავს, უჯრედებში კი ლურჯი გრანულები ჩნდება, ამიტომ თითქოს საღებავს მემბრანა ლურჯი მოლეკულის სახით უნდა გადაეკვეთა. ექსპერიმენტები სხვას გვიჩვენებს. ლურჯი ფორმა მემბრანაში თითქმის არ გადის. მას უფერო ფორმა კვეთს, ხოლო ლურჯი ფერი, რომელსაც შიგნით ხედავთ, სწორედ შიგნით, შეღწევის შემდეგ წარმოიქმნება.
ეს საპირისპირო სურათი მნიშვნელოვანია, რადგან განსაზღვრავს, რისი თქმა შეუძლია შეღებვას და რისი — არა. ლურჯი გრანულები მიუთითებს დაჟანგულ საღებავზე, რომელიც ხელახლა დაიჟანგა და ორგანელებში შეკავდა. ისინი არ გვიჩვენებს უჯრედში საღებავის მთლიან რაოდენობას, არ ასახავს აღდგენილი ფორმის მარაგს და არ ზომავს ბიოლოგიურ ეფექტს. მიზეზის გასაგებად მიჰყევით სამ ეტაპს: ზედაპირზე აღდგენას, აღდგენილი ფორმის დიფუზიას და შიგნით ხელახალ დაჟანგვასა და შეკავებას.
ორი ფორმა სხვადასხვა მოლეკულასავით იქცევა
დაჟანგული მეთილენის ლურჯი ბრტყელი, დადებითად დამუხტული რგოლური სისტემაა. ის წყალში იხსნება, ძლიერ შთანთქავს სინათლეს დაახლოებით 600-დან 700 ნანომეტრამდე დიაპაზონში და ლურჯად გამოიყურება. მთავარი სწორედ მუხტია. დამუხტული, წყლის მოყვარული მოლეკულა ლიპიდურ მემბრანაში ადვილად ვერ გადის, ამიტომ სამეცნიერო ლიტერატურაში ფრთხილად ნათქვამია, რომ მემბრანა მისთვის შედარებით გაუმტარია და არა სრულიად გაუმტარი.
აღდგენილი მეთილენის ლურჯი, რომელსაც ლეიკომეთილენის ლურჯს უწოდებენ, უფერო, დაუმუხტავი და ცხიმში ხსნადია. მუხტის მოცილების შემდეგ მემბრანა კედლის როლს აღარ ასრულებს. აღდგენილი მოლეკულა მასში ადვილად დიფუნდირებს და, უფრო დამჟანგავ უჯრედშიდა განყოფილებაში მოხვედრისას, შეუძლია კვლავ დაკარგოს ელექტრონები და დაუბრუნდეს ლურჯ, დამუხტულ, შეკავებულ ფორმას. ამგვარად, საღებავის ჟანგვა-აღდგენითი ქიმია მისი ტრანსპორტის მექანიზმიცაა. ელექტრონების რაოდენობის შეცვლით გამტარობაც იცვლება.
პირველი ეტაპისთვის საჭირო ელექტრონები თავად უჯრედიდან მოდის. ძუძუმწოვრების უჯრედები ელექტრონებს პლაზმური მემბრანის გავლით გადააქვთ: აღმდგენი ეკვივალენტები უჯრედშიდა დონორებიდან გარეთ, ზედაპირზე მდებარე აქცეპტორებისკენ გადაადგილდება. პლაზმური მემბრანის გავლით მიმდინარე ეს აქტივობა უჯრედის ნორმალური ფუნქციაა და უჯრედთა უმეტეს ტიპში გვხვდება. თიაზინურ საღებავებზე მოქმედი ენდოთელური ზედაპირული რედუქტაზა სხვა მსგავს სისტემებს ერთი მნიშვნელოვანი ნიშნით ჰგავს: ის მუშაობას აგრძელებს ციანიდისა და აზიდის იმ დოზების არსებობისას, რომლებიც შემდგომ ეტაპებს აჩერებს. მთელი ახსნა სწორედ ამ გამიჯვნას ეყრდნობა.
თავდაპირველად განაწილების მოდელი გაჩნდა და მან შეღწევა თითქმის ახსნა
1929 წელს როკფელერის ინსტიტუტში მარიან ირვინმა უფრო მარტივი კითხვა დასვა. იქნებ საღებავის შეღწევა მხოლოდ წყალსა და უჯრედის ცხიმოვან შრეებს შორის განაწილებაა, ხოლო ლაბორატორიულ ცდაში ამ ცხიმოვანი შრეების ჩანაცვლება ქლოროფორმის შრეს შეუძლია. თავის შეღწევის სპექტროფოტომეტრიულ კვლევებში მან საღებავების წყალხსნარები ქლოროფორმთან ერთად შეანჯღრია და ორგანულ ფაზაში გადასული ნივთიერებები ცოცხალ წყალმცენარეთა უჯრედებში შესულ ნივთიერებებს შეადარა.
ამ ნაშრომის ორი მიგნება დღემდე იმსახურებს ყურადღებას. პირველი: მეთილენის ლურჯის კომერციული ხსნარები შეიცავდა ტრიმეთილთიონინს, რომელსაც დღეს azure B ეწოდება. ეს მინარევი თავად მეთილენის ლურჯზე სწრაფად აღწევდა უჯრედში, განსაკუთრებით ტუტე pH-ის პირობებში, როდესაც ლიპიდებში ხსნადი თავისუფალი ფუძის ფორმა ჭარბობს. მეთილენის ლურჯის შეღწევად მიჩნეული ზოგიერთი მოვლენა სინამდვილეში azure B-ის შერჩევითი შეღწევა იყო. მეორე: შედეგს pH განსაზღვრავდა იონიზაციის მდგომარეობის განსაზღვრის გზით, ხოლო დაზიანებული უჯრედები ბევრად მეტ საღებავს უშვებდა შიგნით, ვიდრე დაუზიანებელი უჯრედები. განაწილების კოეფიციენტები და მუხტის მდგომარეობა მართავდა იმას, თუ რას შთანთქავდა ხელოვნური სისტემა და რას — ცოცხალი უჯრედი. ამ ორ სისტემას შორის მსგავსება უჯრედის საზღვარში არაწყლოვანი შრეების არსებობის იდეას ამყარებდა.
ლიპიდებისა და იონიზაციის როლის თვალსაზრისით ეს მოდელი წინმსწრები იყო, თუმცა ვერ არჩევდა საღებავს, რომელიც უცვლელი სახით ნაწილდება, იმ საღებავისგან, რომელიც ზედაპირზე ქიმიურად გარდაიქმნება, სხვა ფორმით გადის მემბრანაში და შიგნით ისევ საწყის ფორმას უბრუნდება. ამ განსხვავების დასადგენად სხვა ექსპერიმენტი იყო საჭირო და ის სამოცდაათი წლის შემდეგ, ფილტვის ენდოთელიუმში ჩატარდა.
აღდგენა გარეთ, შეკავება შიგნით
მერკერი და მისი კოლეგები მსხვილფეხა საქონლის ფილტვის არტერიის კულტივირებულ ენდოთელურ უჯრედებზე მუშაობდნენ და სამეტაპიანი თანმიმდევრობა შემოგვთავაზეს: დაჟანგული საღებავი უჯრედის ზედაპირზე აღდგება თავის უფერო, ლიპოფილურ ფორმამდე; აღდგენილი ფორმა შიგნით დიფუნდირებს; უჯრედშიდა ხელახალი დაჟანგვა კი კვლავ წარმოქმნის დაჟანგულ ფორმას, რომლისთვისაც მემბრანა გაუმტარია და რომელიც უჯრედში გროვდება. შემდეგ მათმა ენდოთელურ უჯრედებში თიაზინების შეღწევის კვლევამ ეს თანმიმდევრობა კონკრეტული ეტაპების შეფერხებით შეამოწმა.
პირველი ინსტრუმენტი იყო ფერიციანიდი — ელექტრონების აქცეპტორი, რომელსაც უჯრედში შესვლა არ შეუძლია. როდესაც ზედაპირული ფერმენტები უჯრედის გარეთ ლურჯ საღებავს უფერო ფორმამდე აღადგენს, ფერიციანიდს შეუძლია ეს ელექტრონები უკან წაიღოს და საკვებ არეში ლურჯი საღებავი აღადგინოს მანამდე, სანამ ის მემბრანას გადაკვეთს. სანამ ფერიციანიდი ჭარბად იყო წარმოდგენილი (10 მიკრომოლარული საღებავი 50-დან 500 მიკრომოლარულ ფერიციანიდთან), საღებავის შეღწევა თითქმის ჩერდებოდა. შეღწევა ნორმალური სიჩქარით მხოლოდ ფერიციანიდის ამოწურვის შემდეგ განახლდებოდა. კინეტიკური მონაცემები იმავე სურათს სხვა გზითაც აჩვენებდა. ფერიციანიდი დაახლოებით მუდმივი სიჩქარით ქრებოდა, რაც შეესაბამებოდა ზედაპირული აღდგენის სტაბილურ ნაკადს, რომელიც ციკლურად მოქმედ მედიატორს ელექტრონებით ამარაგებდა. ამავე დროს, უჯრედგარეთა საღებავი ექსპონენციალურად ქრებოდა, რადგან მისი მარაგი ილეოდა. მუდმივი ნაკადისა და კლებადი მარაგის თანაარსებობა ნიშნავს, რომ ფერიციანიდის სიგნალი უწყვეტ აღდგენას ასახავს და არა საღებავის მოლეკულების ხსნარიდან გასვლას.
მეორე ინსტრუმენტმა მემბრანის გადაკვეთის ეტაპი მთლიანად გამორიცხა. ჯგუფმა თიაზინების ახლო მონათესავე საღებავი, ტოლუიდინის ლურჯი O, პოლიაკრილამიდის დიდ ჯაჭვს მიამაგრა. ეს ჯაჭვი იმდენად დიდი იყო, რომ უჯრედში ვერც ერთ ჟანგვით მდგომარეობაში ვერ შევიდოდა. უჯრედები მაინც აღადგენდა მიმაგრებულ საღებავს. შესაბამისად, აღდგენას უჯრედის შიგნით შეღწევა არ სჭირდება. შესაბამისი მექანიზმი ზედაპირზეა განლაგებული ან მასთან ელექტრულადაა დაკავშირებული.
შემდეგ გამოიკვეთა ის გამიჯვნა, რომელიც ნაშრომის სათაურს განაპირობებს. ციანიდი და აზიდი 2 მილიმოლარული კონცენტრაციით ძლიერ თრგუნავდა საღებავის დაგროვებას. მიკროსკოპით დაკვირვებისას მუქი ლურჯი და იისფერი ჩანართები, რომლებიც ჩვეულებრივ ბირთვს გარს ერტყმის, თითქმის გაქრა. თუმცა არც ერთი ინჰიბიტორი არ ანელებდა უჯრედგარეთა აღდგენას: ფერიციანიდის ციკლური გარდაქმნა შეუფერხებლად გრძელდებოდა და მემბრანაში გაუმავალი პოლიმერიც კვლავ აღდგებოდა. ბლოკირება შემდგომ ეტაპზე ხდებოდა. ციანიდი და აზიდი აჩერებდა უჯრედშიდა ხელახალ დაჟანგვასა და შეკავებას და არა ზედაპირულ აღდგენას. სიცოცხლისუნარიანობის საკონტროლო შემოწმებები ამ ინტერპრეტაციას ამყარებდა: ამ ზემოქმედებების დროს უჯრედები ინარჩუნებდა ციტოზოლურ მარკერ ფერმენტს, ლაქტატდეჰიდროგენაზას. ამიტომ შეღწევის შეწყვეტა მხოლოდ მოწამვლით ან მემბრანის გახეთქვით არ აიხსნებოდა.
ნაშრომში გამოთქმული ერთი გაფრთხილება კვლავ ძალაშია. ლურჯი ჩანართები ბირთვის გარშემო მდებარეობდა და არა მის შიგნით, რაც უჯრედშიდა ორგანელებში მიმდინარე დაჟანგვას შეესაბამებოდა, თუმცა კვლევას არ დაუდგენია, კონკრეტულად რომელ ორგანელებში ხდებოდა ეს. სხვა ტიპის უჯრედებში მსგავსი სურათები მწირი მტკიცებულებების საფუძველზე ლიზოსომურად იყო მიჩნეული. შეკავება დადგენილ ფაქტად ჩათვალეთ, მისი ზუსტი ადგილმდებარეობა კი — ჯერ კიდევ დასაზუსტებლად. მკითხველებს, რომლებიც ელექტრონების შემდგომ გზას აკვირდებიან, შეუძლიათ გააგრძელონ კითხვა მიტოქონდრიულ ელექტრონულ ტრანსპორტსა და ჟანგვა-აღდგენით პროცესებზე და შეწოვისა და განაწილების უფრო ფართო სურათზე შეყვანის გზის მიხედვით.
შეღებვა ექსპოზიცია არ არის
მესამე კვლევა გვიჩვენებს, რა ხდება, როდესაც შეღწევის ეს მექანიზმი ბიოლოგიური მაჩვენებლის შეფასებას უკავშირდება. სკოტმა და მისმა კოლეგებმა დაადგინეს, რომ მეთილ-ბეტა-ციკლოდექსტრინი, რგოლისებრი ტოროიდული ფორმის შაქარი, უშუალოდ უკავშირდება მეთილენის ლურჯს. ჩართვის კომპლექსისთვის ასოციაციის მუდმივა დაახლოებით 310-ს შეადგენს მოლარის შებრუნებული ერთეულით, ხოლო საღებავის დიმერიზაციისთვის — დაახლოებით 5846-ს იმავე ერთეულით. L929 ფიბრობლასტებში ეს შეკავშირება ბლოკავდა როგორც უჯრედების შეღებვას, ისე გლუკოზის ათვისების სტიმულაციას: ციკლოდექსტრინთან წინასწარი ინკუბაცია ხელს უშლიდა ლურჯ შეღებვას, ხოლო მისი შემდგომი დამატება ფერის დაკარგვას აჩქარებდა. უჯრედებიდან ლურჯი ოპტიკური სიგნალის გაქრობის პარალელურად, გააქტიურებული გლუკოზის ტრანსპორტიც მჭიდროდ თანხვედრილი ტემპით მცირდებოდა.
ავტორებმა ეს კორელაცია მიიჩნიეს უფრო მეტად საღებავისა და გლუკოზის ტრანსპორტერის გააქტიურების გზაში მონაწილე ცილის უშუალო ურთიერთქმედების მხარდამჭერად, ვიდრე ხანგრძლივი ოქსიდაციური სტრესის მექანიზმისა. ეს დასკვნა გონივრულია, თუმცა შეზღუდული. ექსპერიმენტი არ ასახელებს ცილას, არ აჩვენებს თავად ტრანსპორტერთან შეკავშირებას, ხოლო ფერის დაკარგვასა და ეფექტის შემცირებას შორის კორელაცია ვერ გამორიცხავს ყველა შესაძლო ჟანგვა-აღდგენით გზას.
მთავარი დასკვნა გაზომვას ეხება. ოპტიკური შეღებვა ასახავს ხილულ, დაჟანგულ, უჯრედთან ასოცირებულ საღებავს. ის მთლიანად გამოტოვებს უფერო, აღდგენილი ფორმის მარაგს, ამიტომ სუსტად შეფერილი უჯრედი შეიძლება მაინც შეიცავდეს საღებავის ეკვივალენტებს. ინტენსიურად შეღებილი უჯრედი კი მიუთითებს შეკავებულ დაჟანგულ საღებავზე და არა ქსოვილის მთლიან ექსპოზიციაზე ან ეფექტის სიდიდეზე. იგივე სიფრთხილე უფრო ფართო მასშტაბზეც საჭიროა: სხვადასხვა ტიპის უჯრედების შეღებვის შედარება ან ქსოვილის მუქი ანათალის უფრო მაღალი ექსპოზიციის მტკიცებულებად მიჩნევა იმავე თავდაპირველ შეცდომას იმეორებს, რომელიც კულტურის ჭურჭელზე დაკვირვებისას წარმოიშვა. შეღწევა აღდგენის, დიფუზიისა და ხელახალი დაჟანგვის ციკლია, ხოლო ლურჯი ფორმის ნებისმიერი ერთჯერადი სურათი მის მხოლოდ ერთ ნაწილს აჩვენებს. აქედან უშუალოდ გამომდინარეობს პრაქტიკული შედეგები ლაბორატორიული შეღებვისა და მასალასთან მუშაობისთვის, ასევე დოზისა და ექსპოზიციის შესახებ მტკიცებების ინტერპრეტაციისთვის.