血液を紫色に染める染色法を開発したのは誰か？ メチレンブルー、マラホフスキー、ロマノフスキー、ギムザ

エオシンは赤い。メチレンブルーは青い。両者を混ぜ、乾燥させた血液塗抹標本に加えると、標本の一部が紫色に染まる。

すべての部分が染まるわけではない。良好な標本では、白血球の核が赤紫色に染まり、マラリア原虫の内部にあるクロマチンも同じ色になる。一方、周囲の赤血球はピンク色、細胞質は灰青色のままだ。この紫色によって、細胞の種類を見分けられる。

どちらの瓶にも紫色は入っていない。メチレンブルーの特定の分解生成物がスライド上でエオシンと出会ったときにだけ、この色が現れる。1880年代と1890年代には、その生成物の正体どころか、存在さえ誰も知らなかった。この色を追い求めた人々は、不純物を含む色素を使い、各自で研究していた。棚に二か月置いた瓶の中身を確かめる、信頼できる方法もなかった。

だからこそ、表題の問いには根拠のある答えが複数あり、2011年にはその答えが変わった。

混合液とともに変わった観察像

この染色法は、一度の発明で生まれたものではない。改良が積み重なってできたものだ。混合液に変更を加えるたびに、新たな情報が一つずつ見えるようになった。その情報が現れた順序を追うと、歴史を最も明確に読み取れる。

重要なのは、最後の列に見られる流れだ。進歩のたびに色の範囲が広がり、そのたびに、さらに一つの構造が見えるようになった。紫色は、この技法を飾るためのものではない。原虫がいると分かることと、その内部構造が分かることの違いを生む。色素そのものがBASFの染料工場から医療の現場へと伝わった経緯には、独自の資料を伴うさらに長い歴史がある。上記の全過程と各項目の出典は、出典リンク付きの貢献者年表にまとめている。

**図：**同じ六つの混合液について、容器に入っていたものと、そこから得られた色を描いている。円は色素を、その下のブロックは、それらの色素が血液塗抹標本で生み出せた色を示す。1890年より前には赤紫色のブロックがなく、それ以降はすべてに含まれている。

意図的にホウ砂を使った人物

エルンスト・マラホフスキーは、現在のヴロツワフに当たるブレスラウの医師だった。生涯にわたって開業医として、また同僚と運営する小さな診療所で働き、勤務の合間に実験室で研究した。1857年3月12日にストシェルノで生まれ、ブレスラウ大学で医学を学んだ。1882年から1887年までは、当時ドイツで二番目に大きかった諸聖人病院の内科で助手を務めた。

1888年、彼はヘンチンスキーとプレーンの二重染色法から研究を始めた。1889年に作製した標本で、マラリア原虫の核のクロマチンが細胞質とは異なる色に染まるのを見たが、その後は再現できなかった。メチレンブルーを酸性にしてみると、結果は悪くなった。ホウ砂でアルカリ性にすると、毎回うまくいった。1890年6月15日にこの方法を公開実演し、1891年8月には、ホウ砂の使用手順を含む、より詳しい記述を発表した。染色には二十四時間かかり、結果は容易に再現できると記している。

診断検査室にとって二十四時間は長く、彼の論文は原虫の核の赤紫色について詳しく論じていなかった。理由はともかく、1898年にノホトが再び行うまで、メチレンブルーを意図的にアルカリ性にする方法は誰にも取り入れられなかった。マラホフスキーが血液染色について再び書くことはなかった。

最近まで彼についてほとんど知られていなかった理由は、謎というよりも、資料の残り方にある。医学文献には彼の人生の痕跡がほとんど残らず、残った資料も一つの経路をたどって伝わった。娘のマリーは1939年にドイツからロンドンへ移り、英国陸軍に従軍した後、カナダに定住した。彼女が保管していた家族の書類は、最終的にニューヨークのレオ・ベック研究所に収蔵された。兄弟のレオは第一次世界大戦で戦死した。姉妹のエヴァは1942年4月、ブレスラウからイズビツァ通過収容所へ強制移送され、二度と戻らなかった。母のヘートヴィヒは、同じ強制移送を待つことを拒み、1942年4月22日に自ら命を絶った。マラホフスキーは、そのすべてが起きる前の1934年に亡くなっていた。

このような結末を迎えた家族の歴史は、引用されることも途絶えてしまう。マラホフスキーを染色法の発展史に再び位置づけた二つの論文は、いずれも2011年に発表され、ポズナンとヴロツワフの公文書資料、およびニューヨークにあるマリーの書類をもとにまとめられた。

カビの生えた瓶と幸運なロシア人

ドミトリー・ロマノフスキーはサンクトペテルブルクの軍医アカデミーで医学を学び、研究人生の大半をマラリア研究に費やした。1890年に発表した方法は、記述上はヘンチンスキーの方法とほぼ同じだった。変性させていないメチレンブルーとエオシンを使い、エオシンの量を少し増やしていた。

1891年9月、彼は自らの名を広めることになった方法を発表した。その重要な詳細は、手順の中に埋もれていた。最良の結果が得られたのは、保存しておいたメチレンブルー溶液、つまりカビが生えた状態で二か月以上置かれていたメチレンブルーの原液を使ったときだった。カビと放置期間によって、色素は部分的に脱メチル化していた。ロマノフスキーはそれを知らず、制御もできなかった。彼の方法を試した他の研究者は、紫色を得られなかった。学位論文は1891年6月にサンクトペテルブルクで提出されており、標準的な説明で1891年を発見の年としているのはそのためだ。

マラホフスキーの実演は、それより一年以上早い1890年6月に行われており、彼の方法では意図的に紫色を得られた。

なぜ別の人物の名が付いたのか

マラホフスキーの優先権を主張する根拠をまとめたのは、クリスティーン・クラフツ、エルンスト・ヘンペルマン、バルバラ・オレクシンである。その主張は四つの点に基づく。公開実演の日付が1890年6月であり、1891年9月より早いこと。意図的だったか、偶然だったかという違い。マラホフスキーはホウ砂の使用を含めて方法を公表したのに対し、ロマノフスキーの方法は制御されていない変数に依存していたこと。そして、偶然に得られた結果を誰も再現できなかったため、マラリア原虫の核に関する記述と、その核を見えるようにした紫色が、実質的に七年間、文献から姿を消したことだ。

彼らは結論を率直に述べている。伝記論文では、その功績の帰属を「歪曲」と呼び、ラルフ・リリーが1978年に書いた「おそらく、この一群の染色法はマラホフスキー染色と呼ぶべきだろう」という言葉を引用している。

優先権の主張にはよくあるように、この主張にも異論がある。ここでは決着をつけるより、何が争われているのかを説明する必要がある。優先権を論じるには、何を発見とするのかを定めなければならない。発見が紫色そのものなら、マラホフスキーには、それを実演したより早い記録がある。発見が公表された方法なら、両者とも1891年に発表しており、染色法にはロマノフスキーの名が付いた。発見が現象の説明なら、どちらにも優先権はない。両者とも、熟成が脱メチル化であることを知らず、そもそもなぜその色が現れるのか説明できなかったからだ。一般向けの説明で省かれるのは、この最後の点である。作用していた成分は、誰も同定していない不純物だった。最初に意図的に紫色を生み出した人物も、その処方で何が起きるかを理解していたのではなく、再現可能な経験的処方によって色を得ていた。

2011年の二つの論文は、マラホフスキーの優先権を支持する論拠を最も詳しく公表したもので、どちらもPubMedから無料で読める。長い総説はPMID 21235291、伝記論文はPMID 21660627にある。総説のPubMed記録には、同年後半に同じ雑誌の86(5):366に掲載されたコメントも記載されている。これは、その主張が発表直後から誌面で争われていたことを示している。

この論争は、化学に関する意見の相違ではない。紫色が何であり、どの成分によって生じるのかについては、関係者全員の見解が一致している。意見が分かれているのは、誰が最初にそこへ到達したのか、そして誰も再現できなかった偶然の結果を、そもそも到達と認めてよいのかという点だ。

後世に名を残した人々がもたらしたもの

マラホフスキーが最初に紫色を生み出したのなら、なぜ染色法にはロマノフスキー、ライト、ギムザの名が付いているのか。

発明者の手で一度だけうまくいく染色法では、試薬として使えないからだ。その後の研究によって、不安定な混合液は、別の国の技師が火曜日の日常業務で使えるものになった。

ノホトは推論によってそこへ到達した。単純な中性色素から安定した結果を得られなかったため、紫色はメチレンブルーの中に含まれる、メチレンブルーではない何かに由来するはずだと考え、それを探した。ウンナはすでに、古くなったメチレンブルー溶液が肥満細胞の顆粒を赤く染めることに気づき、色素の熟成に伴って新しい物質が生じると提案していた。ベルントゼンは1885年に、アルカリ性条件ではメチレンブルーからメチル基が取り除かれ、その生成物が、現在アズール類と呼ばれる物質であることを示していた。ノホトは作用する画分をクロロホルムで抽出したが、それをメチレンブルー由来の赤色物質としか呼べなかった。ミヒャエリスは1901年、それをアズールIと命名した。ジェンナーは取り扱い上の問題を解決した。メチレンブルーとエオシンの沈殿を無水メタノールに再溶解すると、単一の安定した溶液が得られ、染色と同時に塗抹標本を固定できるようになったため、加熱固定が不要になった。リーシュマンとロイターは、多色化した色素とアルコール溶媒を組み合わせ、安定性と紫色の両方を得た。ライトは、65 °Cで十二時間の加温と十日間の静置を、流れる蒸気中での一時間の処理に置き換えた。ギムザは、偶然に熟成した溶液に頼ること自体をやめた。既知の色素を計量して使い、メタノールにグリセロールを加えることで、製品が熱帯の暑さに耐えられるようにした。彼は純粋なメチレンアズールの製造方法を公表しなかった。それをライプツィヒのグリューブラー博士の研究所に販売し、同研究所はアズールIとして売り出した。そして、自社製品だけが真正のギムザ染色液だと主張した。

そのアズールの正体については、今も議論がある。単に多色化したメチレンブルーだったとする見方もあれば、Azure Bを多く含んでいたとする見方もある。その答えは戦争を契機に得られた。ドイツ製の色素が入手できなくなると、米国公衆衛生局のラルフ・リリー、モーリス・ロー、エイミー・ウィルコックスのチームは、分離した三つの成分から最良の染色結果が得られることを突き止めた。その成分は、変性させていないメチレンブルー、その脱メチル化分解生成物であるAzure B、そしてエオシンだった。Azure Bが入手不能になったアズールIに代わり、この三つの成分は、現在もマラリア診断に用いられる染色液の基礎となっている。

この三つの成分がスライド上でどう相互作用するのかという化学は、別の問いであり、別のページで扱う。ロマノフスキー型染色における色素の役割と化学では、Azure Bとエオシンがそれぞれ何をするのか、そしてなぜ両者を組み合わせると、どちらも単独では生み出せない色が現れるのかを説明している。顕微鏡観察と実験室での用途のページでは、実用面を扱う。ある標本で何が見えるのか、そして特定の製品が、使用予定の方法に適しているかをどう判断するのかを説明している。

今も続く歴史の一面

この物語のある一つの事実は、1902年を過ぎても変わらなかった。およそ五十年間、世界で標準的に使われるマラリア染色液の最も重要な成分は、名前のない不純物だった。それは偶然に含まれ、量は瓶ごとに異なり、その期間の一部では正体が企業秘密とされ、配合比率は1940年代まで議論されていた。染色液を使う人々が不注意だったわけではない。瓶の中身を知る手段がなかったのだ。

現代における同じ問題は、材料の一部しか記述しない規格にある。USPへの適合は、市場で提供される最高純度に至る道である。単一の測定値ではなく、同一性、純度、アズール色素を含む有機不純物、残留溶媒、元素不純物、強熱残分、微生物限度、細菌エンドトキシンを網羅した、公表済みの規格だからだ。Blupremeは製薬メーカーからメチレンブルーを調達し、分析証明書の全文を公開している。そのため、この一覧の各項目は、単なる主張として受け入れるのではなく、確認できる。重金属の測定結果だけを記載してUSP適合をうたう証明書は、現代版の「熟成メチレンブルー」と書かれた瓶に相当する。優れた試薬である可能性はあるが、表示だけでは中身は分からない。