EMB寒天培地におけるE. coliとその他のコロニーの外観の読み取り

学生が未知の菌をエオシン・メチレンブルー寒天培地に画線接種し、一晩培養した後、緑色にきらめく暗色のコロニーが生えたプレートを観察します。実験ノートには「E. coli、確認済み」と記載されています。しかし、この記載はプレートから判断できる範囲を超えています。プレートが示すのは、特定の条件下での増殖と発酵の表現型です。菌種の同定は別の判断であり、別の証拠が必要です。

このガイドでは、EMB寒天培地の結果を解釈する方法を扱います。培地の基本原理を説明し、対照を含むプレートの模式図譜を順に確認しながら、教科書的な外観が誤解を招く場合を示します。

プレートの基本原理

EMB寒天培地は、選択培地であると同時に鑑別培地でもあります。色素のエオシンYとメチレンブルーが多くのグラム陽性菌を抑制するため、この培地ではグラム陰性菌が増殖しやすくなります。同じ色素は指示薬としても働きます。菌が利用可能な糖を発酵し、局所的に十分な量の酸を産生すると、コロニーが色素を強く取り込み、濃紫色から青黒色になります。酸産生が活発な場合、コロニー表面に金属様の緑色光沢が現れることがあります。ASMのエオシン・メチレンブルー寒天培地プレートのプロトコルでは、この選択作用と鑑別作用の組み合わせを説明し、教育用の参考写真を掲載しています。

結果を読み取る前に、必ず確認すべき点があります。使用している培地の組成です。古いHolt Harris Teague処方には乳糖とショ糖が含まれますが、Levine EMBには乳糖のみが含まれます。Serratia marcescensの多くの分離株のように、乳糖は発酵せずショ糖を発酵する菌は、この2種類の培地で異なる外観を示すことがあります。EMB培地の製造元資料には、この組成の違いが明記されています。結果と併せて、製造元と培地の組成を実験ノートに記録してください。

調製済みの未接種EMB寒天培地は、通常、赤褐色から赤紫色で、ときに緑がかった色調や微細な沈殿が見られます。この背景色は菌の増殖ではありません。読み取りのたびに未接種プレート、または記録された基準状態と比較してください。実習のプロトコルに別の指定がない限り、35 to 37 Cで約18 to 24時間の好気培養を行った後に、初代培養プレートを読み取ります。培養時間が長くなると、発酵に伴う外観が変化することがあります。

プレートの観察方法

2種類の光を使います。まず反射光または斜光でプレートを観察し、傾けてください。金属光沢は見る角度によって変化するため、角度によって現れたり消えたりします。次に透過光で観察し、コロニーの色と暗色の中心部を確認します。密集したコロニーや隣接するコロニーは、局所的な酸の蓄積に影響し、発色を弱めたり強めたりするため、十分に分離したコロニーを観察してください。ASMの画像集は、この現象を直接示しています。混合培養では、周囲の菌が酸性環境を変えるため、E. coliが通常期待される光沢を示さないことがあります。

実習で可能な場合は、対照を含めてください。教育用によく使われる組み合わせは、青黒色と金属光沢の表現型を確認するE. coli ATCC 25922、無色の表現型を確認するSalmonella Typhimurium ATCC 14028やPseudomonas aeruginosa ATCC 27853などの非発酵菌、そして増殖抑制の対照となるEnterococcus faecalisやStaphylococcus aureusなどのグラム陽性菌です。これらはEMB培地の標準的な品質管理表に記載されています。陽性対照に光沢がない場合は、未知の菌を疑う前に、培養条件、コロニーの密集、培地の組成を疑ってください。

プレートの模式図譜

以下のプレートは生成された模式図であり、実際の培養物の写真ではありません。観察すべきパターンを示すもので、特定の菌株の正確な色調を示すものではありません。ASMの参考写真や、実習室の実際のプレートと比較してください。

プレート1：EMB寒天培地上のEscherichia coli、乳糖を活発に発酵する菌

EMB寒天培地上のE. coliは、通常、濃紫色から青黒色を示し、暗色の中心部と、活発な酸産生による金属様の緑色光沢を伴うことがよくあります。この光沢は、学生が探す代表的な所見ですが、定義ではなく補助的な証拠として扱ってください。光沢の強さは、菌株、培養時間、コロニーの密度、観察角度によって変わります。光沢がなくてもE. coliを除外できず、光沢のない暗色コロニーは、他の複数の発酵菌の可能性も示します。その後の検査には、密集した区画を読み取るのではなく、十分に分離したコロニーを選んでください。

プレート2：EMB寒天培地上のKlebsiella pneumoniae、粘液性の発酵菌

EMB寒天培地上のKlebsiella pneumoniaeは、通常、ピンク紫色から褐紫色の、大きく、つやのある粘液性コロニーを形成します。暗色の中心部を伴うことがよくありますが、通常は強い金属光沢を示しません。Enterobacterなど、関連する発酵菌にも類似した形態が見られます。粘液性の質感とコロニーの大きさも、読み取りの要素です。小さく平坦なピンク色コロニーと、大きくドーム状に盛り上がった粘液性コロニーでは、解釈上の重みが異なります。E. coliの場合と同様に、プレートが示唆するのは発酵の表現型であり、菌種名を付けるには、後述する生化学的な確認が必要です。

プレート3：EMB寒天培地上のSalmonellaとその他の非発酵菌、無色コロニー

EMB寒天培地上のSalmonella、およびShigellaやPseudomonasの多くの分離株を含む他の乳糖非発酵菌は、通常、無色から半透明、または淡い琥珀色のコロニーとして増殖します。組成や条件によっては、わずかにピンクがかった色調になるため、淡いピンク色のコロニーを直ちに発酵菌と判断することはできません。EMBでは、SalmonellaとShigella、またはその他の非発酵菌を区別できません。その区別は後続の検査で行います。また、E. coliに似た金属光沢のあるコロニーを形成する乳糖陽性のSalmonella菌株も報告されています。この点も、1枚のプレートだけでは結論を出せない理由です。

プレート4：Serratia marcescensと培地組成の落とし穴

Serratia marcescensを独立した項目で扱うのは、学生が赤いコロニーを期待し、その結果プレートを誤読しがちだからです。ほとんどの臨床分離株は乳糖を発酵しないため、Levine EMBでは淡色から弱い発色を示すことが一般的です。多くの分離株はショ糖を発酵するため、ショ糖を含む処方では、より暗い色や、酸産生に伴うより強い反応を示すことがあります。35 to 37 Cでは、典型的な赤いプロジギオシン色素も期待しないでください。培養器の温度では、色素産生は安定しません。プロトコルがEMB寒天培地上のSerratia marcescensについて述べている場合は、その記述がどの処方を前提としているかを確認してください。Serratiaの代謝に関する総説では、この落とし穴の背景にある乳糖陰性とショ糖発酵性の変動についてまとめています。

プレート5：対照と増殖が抑制される菌

Staphylococcus、Enterococcus、Streptococcus、Bacillusなどのグラム陽性菌は、一般にEMB寒天培地で増殖が阻害されるか、著しく抑制されます。ただし、すべての菌株で完全に阻害されるわけではありません。対照の組み合わせによって、読み取りの妥当性を確認できます。E. coliの対照は良好に増殖し、青黒色と光沢を示すはずです。非発酵菌の対照は無色で増殖し、増殖抑制の対照はほとんど、またはまったく増殖しないはずです。増殖抑制の対照が良好に増殖した場合は、選択作用が機能しておらず、そのバッチの他のすべての読み取りにも疑いが生じます。染色法と培養培地は、異なる問いに答えるものです。実験室でのスライド染色については、メチレンブルー染色図譜を参照してください。

判断できる範囲を踏まえた比較

誤解を招く外観は、3つの文で整理できます。暗色だからといってE. coliとは限りません。Klebsiella、Enterobacter、その他の発酵菌も、光沢を伴わずに暗色の中心部を形成するためです。ピンク色だからといってKlebsiellaとは限りません。中程度または遅い発酵を示す菌や、通常は非発酵菌とされる一部の菌も、ピンク色や薄紫色に見えるためです。光沢があるからといってE. coliと確定することはできません。他の活発な発酵菌も光沢を生じることがあるためです。教育用プロトコルとその混合培養の図は、これらの判断が成り立たない例を示しています。

確認の限界

EMB寒天培地が示すのは表現型であり、菌種ではありません。異なる菌が同じコロニー外観を示すこともあれば、同じ菌でも菌株、培養の経過時間、密集状態、培地組成、培養条件によって教科書的な外観から外れることもあります。そのため、教育現場や臨床検査の手順では、EMB上の形態を推定所見として扱います。

根拠を示せる学生実習の手順は、分離したコロニーの特徴を記述し、大きさ、色、中心部、斜光での光沢、粘液性を記録することです。併せて、培地組成、培養時間と温度、対照を記録します。その後、確認検査を行う前に、十分に分離したコロニーを継代培養して純培養にします。一般的な後続検査には、E. coliおよび大腸菌群の推定同定のためのグラム染色とIMViC反応、腸内細菌のためのTSIまたはKIAおよび菌に応じた生化学検査パネルが含まれます。目的に応じて、血清学的検査、MALDI TOF、またはその他の妥当性が確認された同定法も用います。腸内細菌用の選択・鑑別培地の中でEMBがどのように位置付けられるかについては、腸内細菌用培地の入門資料と後続検査としてのグラム染色を参照してください。青色のスライド染色で何を証明でき、何を証明できないかという関連する問いについては、メチレンブルー染色図譜でも、同じ考え方で観察と結論を分けています。

結論の前に観察所見を書いてください。「Levine EMBで24時間培養後、角度によって変化する緑色光沢を伴う濃い青黒色のコロニーを認め、活発な乳糖発酵と整合する」という記載には根拠があります。「E. coli、確認済み」と記載するには、プレートだけでは得られない確認の工程が必要です。