メチレンブルーを用いた酵母試験：生細胞の計数と呼吸時間の測定

実験台に2本の試験管が置かれています。どちらも青色です。一方の試験では、顕微鏡で見える青い細胞は死んだ酵母を意味します。もう一方では、試験管の色が青色から無色に変わることが、酵母が生きて呼吸していることを意味します。同じ色素でも、読み取る意味は逆です。2つの試験を混同すると、結論がすべて逆転します。

この記事で扱うのは、この違いです。メチレンブルーは酸化還元色素で、酸化状態では青色、還元状態では無色のロイコメチレンブルーになります。生存率の計数では、この化学的性質を利用して短時間の顕微鏡観察を行います。呼吸実験では、試料全体の反応を時間経過に沿って測定します。それぞれに専用の手順と対照が必要であり、結果を批判的に検討する際の注意点も異なります。

生存率の計数：短時間染色し、速やかに判定する

醸造分野の手順が、最も標準化された方法です。2%クエン酸ナトリウム溶液で0.01% w/vメチレンブルーを調製し、酵母懸濁液と1:1で混合して、あらかじめ決めた短い時間が経過した後に観察します。公表されている染色時間は、Brewing Science Instituteのハンドブックでは1〜2分、研究用の手順では約5分と幅があり、OIVのワイン微生物検査法では10分以内の観察が求められています。計数用混合液の色素濃度は約0.005%になります。改良型Neubauer計数盤に試料を入れ、約400xで濃い青色の細胞を非生存細胞、染色されていない細胞を生存細胞として分類します。OIV法では淡い青色の細胞も生存細胞と判定しますが、この点は後述する判定の主観性の問題をすでに示しています。

細胞濃度は計数盤の寸法から求めます。中央の1 mm四方の区画全体を計数した場合、1 mL当たりの細胞数はNに希釈倍率と10^4を掛けた値になります。Nはその区画内の計数値で、計算方法はASBCの酵母試験法に示されています。生存率の計算はより単純で、染色されていない細胞数を総細胞数で割り、100を掛けます。FEMSの醸造分野における比較研究とOIVの実務に従い、生存率の推定には約400個の細胞を計数します。境界線上の細胞の扱いは、例えば下側と左側の格子線上の細胞を含め、上側と右側の細胞を除外するなど、1つの規則を一貫して適用します。

芽の扱いも、計数を始める前に決める必要があります。一般的には、芽が母細胞の約半分の大きさに達したら別の細胞として数え、それより小さい場合は母細胞と合わせて1個と数えます。どの規則を選ぶ場合でも、すべての区画に適用し、次の担当者が同じ方法を再現できるよう記録用紙に記載します。

計数記録用紙（印刷用）

この記録用紙は、この記事のために作成したオリジナル資料です。ノートに転記するか、試料ごとに1枚印刷してください。

生存率 (%) = 100 x 未染色細胞数 / (未染色細胞数 + 濃い青色の細胞数)。1 mL当たりの総細胞数 = N x 希釈倍率 x 10^4。Nには、定義した計数盤の区画内の計数値を用います。染色時間を結果の横に記録してください。測定時点が明記されていない生存率の数値は再現できません。

生存率の数値が変動する理由

最初の干渉要因は判定のタイミングで、その影響は両方向に働きます。代謝活性のある細胞は色素を還元するため、早すぎる判定では、還元を終えていない生細胞を死細胞と誤分類することがあります。一方、長時間の曝露自体にも毒性があり、実際に損傷した青い細胞を生じさせ、死細胞の染色結果を偽って増やします。そのため、実験室教育用の手順では5分以内の判定を指定しており、ウィスコンシン大学の酵母実習手順にも記載されています。適切な説明は、メチレンブルーによる判定は時間に依存するというものです。したがって、短い染色時間を1つ決め、一連の試料すべてで一定に保ちます。

生存率の低い試料には、もう1つの偏りがあります。標準化された方法では、生存率が約80%を下回ると、メチレンブルーが真の生存率を過大評価する可能性があると警告しています。色素を還元できる細胞が、必ずしも増殖能力を保持しているとは限らないためです。醸造分野の文献でも、生存率が大きく低下した場合に同様の信頼性の低下が記述されています。メチレンブルーは迅速な概算方法として扱い、培養酵母の再投入など、生存率が低い試料について重要な判断を行う場合は、平板培養による計数や補完的な染色で確認してください。

3つ目は試料マトリックスの影響です。OIV法はpH 4.6付近で行い、緩衝能の高い低pH試料では色素が正しく挙動しないと警告しています。また、糖濃度が100 g/Lを超える場合は、細胞が誤解を招く淡い青色に見えるため、この試験を避けるよう勧めています。染色時のpHを比較した実験では、検討した範囲内で感度が大きく変化しており、メチレンブルー法のpH依存性に関する研究と一致しています。夾雑物も別の落とし穴です。夾雑物の多いもろみでは、染色された粒子が死細胞に似て見え、担当者間のばらつきが大きくなります。

このばらつきは、経験談ではなく定量化されています。FEMSの酵母比較研究で報告された6か月間の醸造所試験では、メチレンブルーの重複測定における標準偏差は平均6.1%で、オキソノールを用いたフローサイトメトリーでは0.2%でした。同じ試料でも、2人の担当者による結果には最大13パーセントポイントの差がありました。2023年の生存率測定法の定量的比較では、蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーの精度が大幅に高いことが示されるとともに、測定性能が菌種と試料マトリックスに依存することも示されています。PaintingとKirsopによる古典的な方法の記述（PMID 24430080）は現在も基準となる文献であり、より広範な酵母の生存率と活力の試験に関する総説（PMID 25154541）では、メチレンブルーは決定的な試験ではなく、補完的な試験の1つとして位置づけられています。ここでトリパンブルーに替えれば必ず改善するわけではありません。トリパンブルーは膜の完全性の喪失を示す一方、メチレンブルーは取り込みと還元活性を反映するため、ストレスを受けた細胞は2つの色素で異なる分類になる場合があります。

呼吸実験：青色が消えるまでの時間を測る

2つ目の試験では、顕微鏡を使いません。酵母、グルコース、希薄なメチレンブルーを密閉試験管に入れ、青色が消えるまでの時間を測定します。細胞は代謝に伴って還元当量を生成し、青い色素を無色の形に変換しますが、溶存酸素はそれを再び酸化して青色に戻します。細胞によって酸素濃度が低下すると、全体として還元が優勢になり、試験管内の液が脱色します。したがって、この終点は呼吸、色素濃度、酸素供給の釣り合いを反映します。直接的な酸素分子の消費速度ではなく、メチレンブルーの還元時間または脱色時間として報告すべきです。

測定時間が扱いやすい範囲に収まるよう、生存率測定よりもはるかに希薄な色素を使います。AQAのAレベル必修実験ハンドブックでは、この方法が適切に標準化されています。約30 Cに温めた水100 mL当たりグルコース1 gを加え、使用直前に乾燥酵母5 gを添加します。使用する色素液は、1%原液0.1 mLを100 mLに希釈して約0.001%に調製します。酵母・グルコース懸濁液2 mLと使用色素液2 mLを混合し、試験温度に平衡化させ、10秒間だけ振とうしてタイマーを開始し、その後は振とうしません。振とうすると酸素が再び取り込まれ、試験管内の液が青色に戻ります。これは手順に起因する最大のアーティファクトです。AQAによると、この調製液は通常35 Cで約5分以内に脱色し、試行の平均値は20 Cで275 s、35 Cで128 s、45 Cで145 sでした。これらは1つの実験条件で得られた例であり、普遍的な基準値ではありません。条件を制御した場合の還元速度と代謝活性のある酵母との定量的な関係は、PMID 25773544として索引登録された研究や、Yeast（2014）掲載の機構研究など、還元を対象とした研究によって裏づけられています。

経時変化の実演例（オリジナル資料）

以下の表は、上記のAQA方式の条件を用いて、この記事のために作成したオリジナルの実演例です。酵母・グルコース混合液2 mLと約0.001%の使用色素液2 mLを混合し、10秒間の振とうを1回行った後、静置して培養します。表の数値は、学生グループが記録すべき形式で示した測定値の例で、速度指標は1を秒単位の脱色時間で割った値と定義します。同じ構成の試験管で実験し、これらの記載を実測値に置き換えてください。

試験管A、B、Cについて、温度に対する速度指標をプロットします。曲線は上昇した後に横ばいになるか低下します。これは酵素が関与する反応で予想されるパターンで、直線にはなりません。試験管D、E、Fは、この曲線上のデータ点ではありません。曲線を解釈できるようにするための対照です。

各試験の結果に意味を持たせる対照

呼吸実験には、毎回3種類の対照を併設する必要があります。煮沸または死滅処理した酵母にグルコースと色素を加えた対照は、青色のままであるべきです。これによって、速い還元が生きた細胞の代謝に依存することを確認します。生きた酵母と色素を混合し、グルコースを加えないものは基質対照ですが、酵母は細胞内の貯蔵物質を消費するため、ゆっくりとした脱色は起こり得ます。酵母を含まないグルコースと色素の混合液は化学的ブランクです。アルカリ性条件では、細胞が存在しなくてもグルコースがメチレンブルーを還元できるため、この対照は不可欠です。

生存率の計数には、異なる種類の管理、つまり手順の一貫性が必要です。同じ色素原液、同じ混合比、同じ染色時間、同じ計数盤の区画、同じ芽と境界線の規則を使い、可能な場合は試料情報を伏せて計数します。2人の担当者の結果が10パーセントポイント違う場合、記録用紙を確認すると、通常は原因が分かります。判定のタイミング、青色と判定する閾値、または芽の計数規則の違いです。染色した細胞の調製と観察の技術は、細菌の単染色法にも関連しています。また、さまざまな試料でこの色素が何を染めるかについては、顕微鏡染色アトラスで広く紹介しています。青色の濃さを定量的に読み取る際の物理的原理については、測定条件を明記した吸収の参照資料が、各係数に溶媒、pH、濃度の条件を必ず添える必要がある理由を説明しています。

問いに合わせて試験を選びます。今、生きている細胞が何個あるかという問いは計数の問題であり、顕微鏡と記録用紙で答えます。この培養酵母がどの程度活発に呼吸しているかという問いは反応速度の問題であり、ストップウォッチと条件を制御した試験管で答えます。メチレンブルーは両方に使えますが、同じ試験管で同時に両方を測定することはできません。