Ormesi del blu di metilene: le curve dose-risposta spiegate

Un ratto riceve 4 milligrammi per chilogrammo di blu di metilene dopo aver imparato a riconoscere un oggetto, e il giorno dopo lo ricorda. Un altro ratto ne riceve 50, e muove a malapena la ruota su cui corre. La molecola è la stessa. La direzione dell'effetto no. Chiunque abbia letto più di qualche studio sul blu di metilene si è imbattuto in questa inversione, che ha un nome: ormesi, una risposta bifasica in cui esposizioni basse e alte spingono lo stesso parametro in direzioni opposte.

Il nome è utile solo se si sa che cosa promette e che cosa non promette. Questo articolo esamina quattro serie di dati pubblicate sul blu di metilene, ciascuna con il proprio parametro misurato, intervallo di concentrazione e assetto sperimentale, e mostra perché la chimica del colorante rende plausibili queste inversioni. Si conclude con l'avvertenza imposta dai dati: una curva che raggiunge un picco in un esperimento descrive quell'esperimento, non offre un metodo per scegliere una dose personale.

Il fenomeno ha un nome, e quel nome ha un significato più ristretto di quanto sembri

Il termine ormesi fu coniato nel 1943 da Southam ed Ehrlich e ricevette la sua moderna formulazione quantitativa da Calabrese e Baldwin: una risposta adattativa bifasica, prodotta direttamente o attraverso una compensazione dopo un'alterazione dell'omeostasi. Notate che cosa manca da questa definizione. La parola benefico non compare. L'ormesi dice che la curva cambia direzione, nulla di più.

La forma osservata dipende dal parametro riportato sull'asse verticale. Quando il parametro è una funzione positiva, come l'attività enzimatica, il consumo di ossigeno o il punteggio di memoria, la stimolazione a basse dosi seguita dall'inibizione ad alte dosi disegna una U rovesciata. Quando il parametro è qualcosa di negativo, come l'incidenza di una malattia, la riduzione a basse dosi seguita dall'aumento ad alte dosi disegna una J o una U. Stessa relazione, ordinata diversa. La maggior parte degli studi sul blu di metilene misura funzioni positive, quindi questo articolo parla di curve a U rovesciata, tenendo presente che la lettera dell'alfabeto è una scelta di rappresentazione grafica.

La rassegna del 2008 che ha raccolto le risposte ormetiche del blu di metilene rende concreta l'entità del fenomeno. Nel comportamento, nella fisiologia e nella biochimica, le risposte nella zona di stimolazione raggiungono circa il 130–160 percento del controllo, con una media vicina a 140, prima di scendere nuovamente al livello del controllo e poi al di sotto, mentre la dose continua ad aumentare. Questo intervallo riassume molti esperimenti, non è una proprietà della molecola. Ogni curva qui sotto ha il proprio picco nelle proprie unità.

Perché proprio questa molecola può invertire l'effetto

Il blu di metilene non è un semplice donatore di elettroni. È una navetta reversibile. La forma ossidata, blu, accetta elettroni e diventa la forma ridotta, incolore; la forma ridotta può poi trasferire quegli elettroni più a valle. Il passaggio di elettroni alla base di queste curve è descritto nella spiegazione di come il blu di metilene trasferisce gli elettroni, e qui il meccanismo a navetta è il fulcro dell'intera questione.

A basse concentrazioni, questo ciclo offre alla respirazione una via alternativa. Il colorante ridotto può essere ossidato dalla citocromo ossidasi, l'enzima terminale della catena di trasporto degli elettroni, aumentandone il turnover insieme al consumo di ossigeno e alla capacità respiratoria. A concentrazioni più alte, la stessa chimica avida di elettroni inizia a competere con la catena normale anziché assisterla: devia gli elettroni dal loro percorso abituale, consuma direttamente ossigeno e genera specie reattive dell'ossigeno anziché energia utile. Una piccola navetta catalitica aumenta il flusso; un eccessivo pozzo concorrente di elettroni lo riduce. La chimica rende plausibile un cambio di direzione, ma non garantisce dove un particolare parametro raggiungerà il picco.

Una conferma indipendente della dipendenza dalla concentrazione viene da cellule del tutto prive di mitocondri. Negli esperimenti sugli eritrociti del 1976, una bassa concentrazione di 1 micromolare stimolava la via dell'esoso monofosfato attraverso un meccanismo fortemente dipendente dall'ossiemoglobina, mentre una concentrazione cento volte maggiore, pari a 0.1 millimolare, dipendeva appena dalla presenza di ossiemoglobina e generava perossido di idrogeno, rilevato con tutti e tre i saggi utilizzati. Stesso colorante, due meccanismi, distinti dalla concentrazione. I globuli rossi non possono svolgere la respirazione mitocondriale, quindi questa non è una curva mitocondriale; mostra però che la chimica redox del colorante cambia natura all'aumentare della concentrazione, proprio ciò che richiede la spiegazione mitocondriale.

Quattro curve, quattro assetti sperimentali

La figura qui sotto ridisegna le quattro serie di dati affiancandole. Ogni pannello mantiene i propri assi e le proprie condizioni, perché sovrapporle su un'unica scala sarebbe la prima falsità che questo articolo potrebbe raccontare. Il disegno è schematico; i valori e le condizioni esatti sono riportati nel testo.

Pannello A: citocromo ossidasi in omogenato di cervello di ratto. La curva mitocondriale più chiara è riportata di seconda mano, tracciata nella rassegna a partire da dati su omogenato di cervello di ratto: circa il 138 percento dell'attività del controllo a 0.5 micromolare, ritorno al livello del controllo intorno a 5 micromolare e discesa sotto il valore basale intorno a 10 micromolare, concentrazione alla quale gli autori ipotizzano che il colorante sottragga elettroni ai normali complessi della catena. Omogenato, micromolare, saggio spettrofotometrico. Questa frase racchiude l'intero contesto, e la curva non significa nulla al di fuori di esso.

Pannello B: memoria dei ratti e corsa sulla ruota. Nello studio sulla memoria dei ratti, gli effetti di singole iniezioni successive all'addestramento venivano valutati 24 ore dopo. Dosi da 1 a 10 milligrammi per chilogrammo lasciavano locomozione e alimentazione indistinguibili da quelle osservate con la soluzione salina, mentre dosi da 50 a 100 milligrammi per chilogrammo riducevano nettamente la corsa sulla ruota (mediana di 35 contro 279 giri) e la dose più alta causava piloerezione, movimenti scoordinati e un decesso. La dose di 4 milligrammi per chilogrammo migliorava l'abituazione e il riconoscimento degli oggetti: i ratti trattati dedicavano quasi 10 secondi in più all'oggetto nuovo. Il consumo di ossigeno cerebrale aumentava sia nell'omogenato esposto al colorante ridotto a basse concentrazioni micromolari, sia nei cervelli prelevati 24 ore dopo la somministrazione in vivo di 1 milligrammo per chilogrammo. Notate la distinzione: per il comportamento si usavano dosi sistemiche dopo l'addestramento, per il consumo di ossigeno concentrazioni nell'omogenato più una dose in vivo; sono due esperimenti, non una sola curva.

Pannello C: labirinto a T nei pesci zebra. Lo studio sui pesci zebra immergeva i pesci addestrati per 12 ore dopo l'addestramento in bagni con concentrazioni nominali di 0.1, 0.5, 5.0 o 10.0 micromolare, confrontandoli con un controllo contenente un colorante alimentare blu. Il gruppo a 0.5 micromolare otteneva i risultati migliori, il gruppo a 5.0 eguagliava il controllo e quello a 10.0 aveva prestazioni peggiori rispetto ai gruppi a dosi più basse. Il pannello richiede due cautele. Una concentrazione micromolare nel bagno non equivale a una concentrazione micromolare nel sangue o nel cervello; tra l'acqua della vasca e il tessuto intervengono distribuzione e accumulo. Inoltre, il supporto statistico è più debole di quanto suggerisca la forma: la dose elevata differiva dai gruppi a dosi più basse, senza altre differenze significative tra gruppi riportate. La curva è reale, ma approssimativa.

Pannello D: la via dell'esoso monofosfato negli eritrociti. Metz e colleghi confrontarono 1 micromolare con 0.1 millimolare in globuli rossi umani esposti ad aria, monossido di carbonio e a una miscela che produceva una conversione quasi totale in carbossiemoglobina a una pressione fisiologica di ossigeno. La stimolazione a bassa dose crollava in assenza di ossiemoglobina; quella ad alta dose ne risentiva appena. Il perossido compariva solo alla dose elevata. Questo pannello va affiancato agli altri per la chimica, non come quarto punto di un'ipotetica curva universale: nessun mitocondrio, concentrazioni distanti di un fattore cento, miscele di gas manipolate.

Perché i picchi non coincidono, e non dovrebbero

I quattro picchi si collocano a 0.5 micromolare in un omogenato, a 4 milligrammi per chilogrammo iniettati dopo l'addestramento, a 0.5 micromolare nell'acqua della vasca e in una coppia di concentrazioni bassa e alta distanti di un fattore cento nei globuli rossi. Trattare due qualsiasi di questi valori come lo stesso numero è un errore di categoria. Ogni parametro ha la propria curva: l'optimum per la memoria non deve necessariamente coincidere con quello per l'attività dell'ossidasi, il consumo di ossigeno, la locomozione o la produzione di perossido. Ogni unità di concentrazione indica qualcosa di diverso: la concentrazione micromolare nell'omogenato, quella nominale nel bagno, i milligrammi per chilogrammo somministrati per via sistemica e le concentrazioni plasmatiche, cerebrali e mitocondriali sono grandezze diverse; la tendenza del blu di metilene ad accumularsi nei mitocondri e nel cervello mantiene queste differenze. Ogni modello aggiunge la propria farmacocinetica: specie, via di somministrazione e tempi determinano quale tessuto incontri quanto colorante e per quanto tempo.

È qui che conta anche il ruolo della dose e della via di somministrazione nella sicurezza del blu di metilene, perché gli effetti delle dosi elevate in questi studi — riduzione dell'attività motoria, movimenti scoordinati, un ratto morto, generazione di perossido — sono segnali di tossicità nei rispettivi assetti sperimentali, non margini di sicurezza per altri contesti. Chi fosse tentato di convertire 4 milligrammi per chilogrammo in un ratto in un regime di somministrazione umano dovrebbe prima leggere come i risultati sugli animali si rapportano alle evidenze nell'uomo: una semplice conversione in milligrammi per chilogrammo tra specie è inadeguata.

L'errore da evitare

La U rovesciata è seducente perché sembra una manopola per regolare la dose, con il punto ottimale già segnato. Non lo è. L'ormesi descrive ciò che è accaduto a un parametro in un assetto sperimentale. Mettendo insieme quattro descrizioni di questo tipo si ottengono quattro picchi in quattro sistemi di unità, il contrario di una manopola. L'uso corretto di queste curve è comparativo e prudenziale: aspettarsi che gli effetti si invertano con la concentrazione, aspettarsi che ogni parametro si inverta al proprio punto e diffidare di qualsiasi affermazione che prenda in prestito il picco di un esperimento per giustificare una dose in una specie, per una via di somministrazione, in un tessuto o per uno scopo diversi. La distinzione tra andamenti sperimentali e decisioni sul dosaggio personale è il punto centrale dell'intero articolo, ribadito ancora una volta perché non sfugga.

Come leggere il prossimo studio dose-risposta

Quattro domande si adattano a quasi ogni curva del blu di metilene che incontrerete. Quale parametro è riportato sull'asse verticale, e la sua inversione disegnerebbe una U o una J. Quale concentrazione riporta effettivamente l'asse orizzontale: nominale nel bagno, nell'omogenato, nel plasma, stimata nel cervello oppure dose sistemica somministrata. Quale modello e quali tempi l'hanno prodotta: omogenato, coltura cellulare con le luci accese o spente, animali addestrati trattati prima o dopo l'addestramento, valutati quando. E quale fosse il controllo: soluzione salina, colorante alimentare blu, veicolo; inoltre, se le analisi statistiche dello studio sostengano ogni affermazione basata sul confronto tra coppie o soltanto la forma complessiva. Uno studio che risponde a tutte e quattro merita il vostro tempo. Uno che riporta un picco senza queste informazioni vi ha dato un numero senza un indirizzo.