Blu di metilene e Bartonella: risultati di laboratorio e limiti delle evidenze cliniche

Una piastra di coltura e un paziente condividono una parola, infezione, ma non un concetto. Nella piastra, l'infezione è una conta di colonie su agar. Nel paziente, significa batteri all'interno di cellule e vasi, farmaci che attraversano sangue e tessuti e un sistema immunitario che svolge parte del lavoro. Confondere le due cose fa sì che un dato di laboratorio sorprendente inizi a sembrare un trattamento. Tenerle separate restituisce allo stesso dato il suo vero significato: un motivo per condurre l'esperimento successivo.

Mantenere questa distinzione è l'intero scopo di questa rassegna sul blu di metilene e Bartonella. Due studi di laboratorio dello stesso gruppo di ricerca hanno testato il blu di metilene contro Bartonella henselae in stati di non crescita. Entrambi hanno riportato una forte attività in contenitori di vetro e plastica. Nessuno dei due ha condotto test su persone.

Perché i ricercatori studiano la fase stazionaria

La maggior parte dei test sugli antibiotici utilizza cellule in crescita. Questo modello non coglie un caso più difficile: cellule che hanno smesso di dividersi e tollerano farmaci che uccidono le loro controparti in crescita.

Bartonella può persistere nell'organismo, anche all'interno degli eritrociti e delle cellule endoteliali. Il gruppo si è quindi chiesto quali farmaci approvati possano uccidere B. henselae dopo il suo ingresso nella fase stazionaria. Una MIC bassa contro le cellule in crescita non prediceva l'uccisione delle cellule in fase stazionaria. La rifampicina aveva una MIC molto bassa, ma uccideva scarsamente le cellule stazionarie, mentre composti con valori di MIC più elevati le uccidevano efficacemente. Chi desidera un metodo generale per leggere questo tipo di articolo lo troverà nella guida alla lettura della ricerca sul blu di metilene.

Primo screening: Li e colleghi, 2019

Lo screening del 2019 sulla fase stazionaria pubblicato su Antibiotics utilizzava un unico ceppo, B. henselae JK53, coltivato in terreno Schneider con il 10 percento di siero fetale bovino a 37 C con il 5 percento di CO2. Le colture di un giorno erano costituite soprattutto da cellule disperse in divisione. Le colture di cinque giorni, con circa 10 all'8ª unità formanti colonia per mL, erano considerate in fase stazionaria e contenevano aggregati visibili.

Il saggio utilizzava SYBR Green I con ioduro di propidio, calibrato su miscele di cellule vive e cellule uccise con isopropanolo. Poiché il blu di metilene è fortemente colorato, i risultati positivi venivano confermati mediante microscopia e poi tramite conteggi delle colonie su agar sangue, il criterio di valutazione più rigoroso.

Tra 1,581 farmaci approvati testati a 50 micromolare, il blu di metilene lasciava una vitalità residua del 16 percento secondo il lettore di piastre e del 25 percento secondo la microscopia. La daptomicina registrava il 21 percento, diversi azoli dal 22 al 27 percento, la gentamicina il 32 percento, l'eritromicina il 66 percento e la ciprofloxacina il 74 percento. Il pamoato di pirvinio appariva più attivo al lettore, ma non poteva essere valutato al microscopio a causa della sua fluorescenza.

Contro B. henselae in crescita, la MIC del blu di metilene era compresa tra 0.08 e 0.16 microgrammi per mL. Contro le cellule stazionarie di cinque giorni, a 5 microgrammi per mL, il conteggio scendeva a nessuna colonia rilevabile dopo un giorno di esposizione, eguagliando la daptomicina e il pamoato di pirvinio alle rispettive concentrazioni testate. Un esperimento separato sulla cinetica di uccisione utilizzava 10 microgrammi per mL. Si tratta di livelli di esposizione in laboratorio, non di dosi, e l'articolo li presenta come tali. Un valore di picco plasmatico nell'uomo vicino a 3.9 microgrammi per mL, citato nell'articolo, compare soltanto come informazione di contesto. La panoramica sulla farmacocinetica del blu di metilene spiega perché un valore plasmatico non possa essere interpretato come un valore tissutale.

Nell'articolo sono esplicitati due limiti. Non erano presenti né un modello di biofilm né test di combinazioni con il blu di metilene. Gli aggregati di cinque giorni erano gruppi di cellule in una coltura liquida stazionaria, non un esperimento validato sul biofilm. Gli autori auspicavano studi su animali, sulle combinazioni, sui biofilm e su altre specie di Bartonella.

Combinazioni e cellule derivate da biofilm: Zheng e colleghi, 2020

Lo studio successivo del 2020 pubblicato su BMC Microbiology manteneva lo stesso ceppo e lo stesso terreno, ma passava a colture stazionarie di sei giorni e aggiungeva due elementi assenti nel primo articolo: combinazioni di due farmaci e un modello di cellule derivate da biofilm.

Per i singoli farmaci, testati tutti a 5 microgrammi per mL per 24 ore, il blu di metilene lasciava 3.2 × 10 alla 4ª unità formanti colonia per mL, rispetto a un controllo vicino a 2.8 × 10 alla 10ª. Ciprofloxacina, gentamicina e nitrofurantoina lasciavano meno colonie allo stesso momento di valutazione. Questo risultato differisce da quello del 2019, in cui lo stesso livello nominale non lasciava colonie rilevabili dopo un giorno. L'età, la densità e la manipolazione delle colture erano diverse, quindi l'attività di uccisione era riproducibile nella direzione dell'effetto, ma non identica nell'entità. Questa variazione tra esperimenti è uno dei motivi per cui le verifiche standard di sicurezza e delle interazioni trattano la potenza in laboratorio separatamente dall'effetto clinico.

Lo screening delle combinazioni è la parte più citata. Ogni componente era fissato a 5 microgrammi per mL. Sia azitromicina più blu di metilene sia rifampicina più blu di metilene non lasciavano colonie rilevabili in fase stazionaria a 24 ore, così come entrambe le combinazioni con ciprofloxacina: soltanto queste quattro tra le 25 coppie testate. Non è stata condotta un'analisi formale della sinergia, quindi il termine corretto è combinazione attiva in queste condizioni, non sinergia dimostrata.

L'esperimento sul biofilm testava cellule recuperate da un biofilm giovane disgregato, non la penetrazione in un biofilm maturo intatto. Le colture venivano fatte crescere per cinque giorni, diluite in piastre a pozzetti per altri cinque giorni, confermate mediante colorazione con cristalvioletto e poi raschiate prima dell'esposizione ai farmaci. A 5 microgrammi per mL, con il solo blu di metilene il conteggio scendeva a 2.3 × 10 alla 2ª entro il giorno 6, collocandolo tra i migliori agenti singoli, ma senza raggiungere lo zero. Entrambe le combinazioni con blu di metilene raggiungevano lo zero entro il giorno 6, così come entrambe le combinazioni con ciprofloxacina.

Gli autori segnalavano gli stessi limiti che rileverebbe un lettore attento: un biofilm giovane raschiato invece di un biofilm vecchio intatto, un'unica concentrazione pratica per tutti i farmaci anziché ciascun farmaco al proprio picco realistico, soltanto coppie selezionate incentrate su azitromicina o rifampicina, un solo ceppo, nessun animale, nessun paziente. Successivi studi con tre farmaci venivano proposti, non riportati.

Confronto dei disegni degli studi

La tabella riassume il punto centrale di questo articolo. Tutto ciò che si trova a sinistra dell'ultima colonna riguarda il lavoro in coltura. Nessun dato di entrambi gli articoli rientra nell'ultima colonna.

Bartonella non è Borrelia

Entrambi gli articoli menzionano Borrelia burgdorferi, la spirocheta responsabile della malattia di Lyme, perché il saggio con coloranti derivava da precedenti studi sulla fase stazionaria di Borrelia nello stesso laboratorio, nei quali anche il blu di metilene e la daptomicina erano risultati attivi. Questa storia offre un contesto utile ed è una fonte comune di errori.

Nessun esperimento nei due articoli su Bartonella testa Borrelia parallelamente a Bartonella. Gli organismi differiscono, i terreni differiscono, le concentrazioni differiscono e l'ipotizzato effetto del blu di metilene sulla membrana di Bartonella era presentato come una congettura che richiedeva ulteriori studi. I risultati non vanno trasferiti da una specie all'altra e nessuno dei due articoli supporta affermazioni generali sui parassiti. Per questo motivo, il confronto tra le cellule persistenti di Borrelia e Bartonella mantiene separate le due letterature scientifiche.

Perché le colture non si trasformano in un protocollo

L'interesse nelle ricerche di un protocollo con blu di metilene per Bartonella è comprensibile. Questi articoli spiegano perché tale espressione debba essere trattata come un segnale d'allarme, non come una lista della spesa.

Primo, 5 microgrammi per mL in un pozzetto non sono una prescrizione. Questo valore non comprende assorbimento, distribuzione, legame con le proteine, penetrazione intracellulare o tollerabilità. Gli autori lo hanno scelto come media approssimativa dei picchi degli antibiotici e hanno affermato che gli studi futuri dovrebbero utilizzare ciascun farmaco al proprio livello realistico.

Secondo, zero colonie significa nessuna colonia in quelle condizioni di semina su piastra, non tessuti sterili. Cellule persistenti, batteri intracellulari e limiti del campionamento restano tutti al di fuori della piastra di agar.

Terzo, le combinazioni che sterilizzano un pozzetto possono fallire o causare danni nell'organismo. Azitromicina più blu di metilene e rifampicina più blu di metilene sono coppie di laboratorio a livelli di esposizione di laboratorio. Senza farmacocinetica animale e dati controllati nell'uomo, non ci sono né dose, né durata, né rapporto beneficio-rischio. Chiunque stia valutando delle opzioni dovrebbe discuterne con un medico e consultare le indicazioni su quando l'uso del blu di metilene richiede supervisione medica prima di trarre qualsiasi conclusione dai dati ottenuti in piastra.

La conclusione circoscritta che questi articoli supportano è questa: il blu di metilene ha un'attività riproducibile contro B. henselae JK53 non in crescita in vitro, anche in combinazioni di due farmaci in laboratorio, e i risultati più marcati sulle combinazioni e sulle cellule derivate da biofilm provengono dallo studio del 2020. Tutto il resto, compreso se tale attività sia rilevante per la bartonellosi nell'uomo, rimane da verificare.