Agar EMB versus agar MacConkey: selezione e interpretazione dei terreni

Uno studente semina per striscio lo stesso campione d'acqua su due piastre. Su una compaiono colonie scure con un riflesso metallico verde. Sull'altra compaiono colonie rosa intenso con un alone opalescente. Entrambe le piastre sono state inoculate dalla stessa provetta, incubate fianco a fianco e lette alla stessa ora. Lo studente chiede quale piastra sia quella corretta.

Entrambe le piastre sono corrette. Rispondono a domande diverse. La confusione nasce dal considerare i due terreni come mezzi intercambiabili per lo screening dei batteri intestinali. Hanno uno scopo comune, cioè selezionare organismi enterici Gram negativi e distinguere i fermentatori del lattosio dai non fermentatori, ma realizzano questo scopo con una chimica diversa e una diversa logica visiva. Una volta compresi i due concetti di base, la selezione della piastra e la lettura delle colonie diventano operazioni di routine.

La risposta breve

L'agar EMB utilizza due coloranti, eosina Y e blu di metilene, che svolgono una doppia funzione: inibiscono la crescita dei Gram positivi e precipitano attorno ai forti produttori di acido, creando colonie scure, classicamente con un riflesso metallico verde per Escherichia coli. L'agar MacConkey separa le funzioni: i sali biliari più il violetto di cristallo inibiscono i Gram positivi, il lattosio alimenta la fermentazione e il rosso neutro segnala la produzione di acido formando colonie rosa o rosse. Se l'obiettivo è una dimostrazione presuntiva visivamente evidente di E. coli, EMB ha un ruolo specifico. Se l'obiettivo è distinguere chiaramente i fermentatori del lattosio rosa dai non fermentatori incolori, soprattutto nei flussi di lavoro su feci o urine, MacConkey è generalmente più semplice da leggere. Nessuna delle due piastre identifica un organismo soltanto in base al colore.

EMB: coloranti che selezionano e indicano contemporaneamente

Il concetto dell'EMB integra selezione e indicazione nelle stesse molecole. Il protocollo ASM per l'agar eosina-blu di metilene descrive EMB come un terreno sia selettivo sia differenziale, in cui la coppia di coloranti inibisce molti organismi Gram positivi mentre la fermentazione del lattosio determina l'assorbimento e la precipitazione dei coloranti. Una formulazione Levine standard contiene peptone, lattosio, fosfato, eosina Y, blu di metilene e agar, come indicato nel metodo FDA BAM per l'agar EMB Levine. Va notato che alcune formulazioni EMB più vecchie aggiungevano saccarosio insieme al lattosio, mentre l'EMB Levine contiene lattosio senza saccarosio; è quindi necessario registrare quale formulazione utilizza il proprio laboratorio.

Leggere l'EMB significa osservare il comportamento dei coloranti. Una fermentazione vigorosa del lattosio produce una quantità di acido sufficiente a determinare una marcata precipitazione dei coloranti, conferendo a E. coli centri blu-neri scuri e, nel caso classico, un riflesso metallico verde alla luce riflessa. I fermentatori più deboli, come Enterobacter e Klebsiella, crescono tipicamente come colonie mucose da rosa a viola prive di tale riflesso. I non fermentatori come Salmonella, Shigella e Proteus crescono generalmente come colonie incolori o traslucide perché non producono il rapido aumento di acidità necessario a far precipitare i coloranti. I Gram positivi sono generalmente inibiti, anche se il grado di inibizione varia in funzione del ceppo e del prodotto. La chimica completa della preparazione dei coloranti, compreso il motivo per cui il blu di metilene si comporta innanzitutto come colorante cationico, appartiene a una trattazione separata delle formulazioni dei coloranti, mentre il contesto microscopico generale è illustrato in un atlante dei metodi di colorazione. Questo articolo si concentra sulla selezione e sulla lettura delle piastre.

La figura sopra è illustrativa. Mostra la logica visiva attesa: colonie scure con riflesso, tipi mucosi rosa e tipi chiari su EMB, rispetto a tipi rosa e chiari su MacConkey. Usala per apprendere il pattern, quindi conferma ogni interpretazione confrontandola con controlli fotografici e con il foglietto illustrativo del prodotto relativo all'esatto terreno presente sul banco di lavoro.

MacConkey: funzioni separate, regola visiva più semplice

Il concetto del MacConkey assegna ogni funzione a un ingrediente distinto. Il protocollo ASM per l'agar MacConkey presenta lo stesso principio selettivo e differenziale, mentre il metodo FDA BAM per l'agar MacConkey elenca i componenti funzionali: peptoni, lattosio, sali biliari, sale, rosso neutro, violetto di cristallo e agar. I sali biliari insieme al violetto di cristallo esercitano una selezione contro i Gram positivi. Il lattosio fornisce il substrato per la fermentazione. Il rosso neutro agisce da indicatore di pH, passando al rosa o al rosso dove si forma acido, talvolta accompagnato da precipitazione della bile attorno ai forti fermentatori.

La regola di lettura è volutamente semplice: rosa significa fermentatore del lattosio, mentre incolore o chiaro significa non fermentatore. E. coli appare da rosa a rosso, spesso con un alone di precipitato biliare. Klebsiella ed Enterobacter appaiono rosa e spesso mucosi a causa delle loro capsule. Salmonella, Shigella, Proteus e molti altri bacilli Gram negativi appaiono incolori. Un ulteriore vantaggio è rilevante nei laboratori didattici: i sali biliari generalmente riducono lo sciamamento di Proteus, rendendo più facile ottenere colonie isolate su MacConkey rispetto ai terreni non selettivi, anche se l'inibizione non è assoluta ed esistono alternative prive di sale quando il controllo dello sciamamento è la priorità.

La ragione molecolare del comportamento di questi coloranti dipende dalla carica e dalla struttura. Il blu di metilene è un colorante fenotiazinico cationico le cui struttura e proprietà spiegano la sua affinità per le superfici batteriche acide, la stessa affinità che interviene quando precipita nelle zone acide sull'EMB.

Confronto a colpo d'occhio

Leggi la tabella come una procedura decisionale. Quando l'esercitazione richiede che gli studenti vedano un gradiente dell'intensità di fermentazione con un risultato finale particolarmente evidente, EMB lo mostra. Quando l'esercitazione richiede una rapida distinzione binaria prima della conferma biochimica, MacConkey la mostra.

Quale terreno per quale campione

Per esercitazioni sull'acqua finalizzate al riconoscimento presuntivo di coliformi fecali o E. coli, EMB è interessante perché il riflesso è visivamente distintivo. Anche MacConkey consente di lavorare con enterobatteri Gram negativi ed è stato storicamente utilizzato nell'analisi dell'acqua, ma nessuna delle due piastre sostituisce un metodo normativo per l'analisi dell'acqua, che può specificare terreni come mTEC modificato o MI a seconda del test. Verifica il metodo che il tuo laboratorio è tenuto a seguire.

Per separazioni di tipo fecale tra fermentatori e non fermentatori, MacConkey è generalmente il più utile dei due. Nella pratica, l'analisi delle feci per Salmonella o Shigella prevede normalmente l'aggiunta di terreni enterici più selettivi, come XLD o Hektoen enteric, anziché affidarsi al solo MacConkey.

Per esercitazioni sulle urine che riproducono un flusso di lavoro clinico, abbina MacConkey all'agar sangue. MacConkey fornisce una prima selezione dei Gram negativi, mentre l'agar sangue consente la crescita di organismi che MacConkey inibisce. Questo abbinamento è standard nelle descrizioni cliniche dell'allestimento delle urinocolture.

Per l'insegnamento puro dei concetti, utilizza entrambi. EMB mostra che l'intensità della fermentazione è importante e che una stessa molecola può svolgere due funzioni. MacConkey mostra una progettazione modulare: selettore, substrato e indicatore mantenuti separati. Gli studenti che seminano per striscio un E. coli noto, un Klebsiella aerogenes noto e una Salmonella nota fianco a fianco su entrambi i terreni raramente confondono di nuovo le due logiche.

Errori di lettura che si ripetono ogni semestre

L'errore più comune è identificare un organismo soltanto in base al colore. Una colonia rosa su MacConkey può essere E. coli, Klebsiella, Enterobacter o un altro fermentatore. Una colonia incolore può essere Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas o un altro non fermentatore. Il colore è un fenotipo di screening che orienta gli esami di conferma, come colorazione di Gram, ossidasi, pannelli biochimici o identificazione strumentale, non un nome di specie.

Il secondo errore consiste nel dare troppo peso all'assenza del riflesso. Alcune autentiche colonie di E. coli, soprattutto quelle isolate, producono un riflesso metallico minimo o assente sull'EMB. L'assenza del riflesso non esclude E. coli e la sua presenza non lo dimostra. Considera il riflesso come un indizio presuntivo.

Il terzo errore è confrontare piastre di età diversa. I fermentatori tardivi del lattosio possono diventare rosa su MacConkey dopo un'incubazione prolungata, rendendo meno netta la distinzione tra fermentatori e non fermentatori. Esegui la lettura all'ora specificata dal laboratorio e registra il tempo di incubazione insieme al risultato.

Il quarto errore consiste nell'interpretare una crescita mista come un unico organismo. Una colonia rosa accanto a una colonia incolore rappresenta due fenotipi, non una forma intermedia. Seleziona colonie ben isolate e analizza separatamente ogni morfotipo. Anche la consistenza mucosa può trarre in inganno: sia Klebsiella sia Enterobacter possono apparire mucosi, quindi la capsula da sola non consente mai di stabilire il nome. L'organismo un tempo insegnato come Enterobacter aerogenes è ora classificato come Klebsiella aerogenes, il che spiega perché le vecchie tabelle e le denominazioni più recenti possano sembrare in disaccordo.

Controlli e una regola conclusiva

Esegui in ogni sessione controlli fotografici o freschi: E. coli per la reazione del forte fermentatore, Klebsiella aerogenes per la fermentazione mucosa senza il riflesso classico, un ceppo di Salmonella per la reazione incolore del non fermentatore e Staphylococcus aureus per confermare l'inibizione dei Gram positivi con il prodotto specifico utilizzato. Fai corrispondere i numeri dei ceppi e i criteri di accettazione al foglietto illustrativo del produttore, perché la selettività varia con il contenuto di bile, violetto di cristallo e coloranti.

Ricorda una frase al banco di lavoro. EMB utilizza coloranti che selezionano e segnalano contemporaneamente, offrendo un segnale evidente per E. coli a fronte di una lettura più sfumata. MacConkey separa la selezione dalla segnalazione, offrendo una distinzione semplice tra rosa e chiaro a fronte di un minor dettaglio sull'intensità della fermentazione. Scegli il terreno il cui principio corrisponde alla domanda, conferma il colore con test appropriati e le due piastre smetteranno di competere e inizieranno a completarsi a vicenda.