Valkostir við metýlenblátt fyrir smásjárskoðun

Fyrir einfalt bakteríustrok getur kristalfjólublátt komið í stað metýlenblás þegar markmiðið er að sjá lögun frumna. Fyrir lifandi frumur getur betri kostur verið fasaskil án nokkurrar litunar. Valið fer eftir þeirri athugun sem þarf að gera.

Gerum ráð fyrir að tveir aðilar skoði sömu bakteríurækt. Annar vill greina staflaga frumur frá kringlóttum frumum. Hinn vill vita hvort meðferð hafi drepið bakteríurnar. Litun sem gefur þeim fyrri skýra mynd gæti ekki gefið þeim síðari neitt nothæft svar.

Áður en staðgengill er valinn skaltu ljúka þessari setningu: „Ég þarf að skoða ___ í ___, og frumurnar þurfa / þurfa ekki að haldast lifandi.“ Sú setning skilgreinir verkefnið sem litunin þarf að leysa.

Byrjaðu á sýninu og spurningunni

Ákveddu fyrst hvort frumurnar þurfa að haldast lifandi og skilgreindu síðan eiginleikann sem þarf að skoða:

Frumurnar þurfa að haldast lifandi: fyrir hreyfingu eða lögun skaltu íhuga ólitað fasaskil eða DIC; fyrir DNA í kjarna skaltu íhuga Hoechst 33342 með flúrljómun; fyrir heilleika frumuhimnu skaltu velja fullgilta prófun eins og SYTO 9 með propidium iodide.
Frumurnar þurfa ekki að haldast lifandi: fyrir formgerð baktería skaltu íhuga einfalda litun með kristalfjólubláu eða neikvæða litun með nígrósíni; fyrir Gram-svörun skaltu nota fulla Gram-litunaraðferð; fyrir DNA í kjarna í festum frumum skaltu íhuga DAPI-flúrljómun. Notaðu þessa töflu til að bera saman takmarkanir hvers valkosts. Þetta eru val á aðferðum, ekki leiðbeiningar um að skipta um flöskur innan fyrirliggjandi aðferðarlýsingar.

Það sem þarf að skoða	Sýni og búnaður	Mögulegur valkostur	Helsta takmörkun
Lögun og uppröðun baktería	Undirbúið bakteríustrok; bjartsvið	Einföld litun með kristalfjólubláu	Sýnir formgerð; staðfestir hvorki Gram-svörun né lífvænleika.
Útlínur frumna gegn dökkum bakgrunni	Bakteríufræðilegt sýni; bjartsvið	Neikvæð litun með nígrósíni	Undirbúningur og samsetning skipta máli; ólituð fruma er ekki endilega lifandi.
Gram-svörun	Undirbúið bakteríustrok; bjartsvið	Full Gram-litunaraðferð	Krefst allrar raðar hvarfefna og viðmiða.
Hreyfing eða breytingar í lifandi frumum	Samhæft blautsýni; fasaskil eða DIC	Engin litun	Krefst viðeigandi ljósbúnaðar; birtuskil auðkenna ekki sameind.
DNA í kjarna	Festar frumur; flúrljómun	DAPI	Krefst samhæfra örvunar- og útgeislunarsía.
DNA í kjarna í lifandi frumum	Lifandi frumur; flúrljómun	Hoechst 33342	Innganga í frumur staðfestir ekki að myndgreiningarskilyrðin séu skaðlaus.
Heilleiki frumuhimnu baktería	Ófestar bakteríur; flúrljómun	SYTO 9 með propidium iodide	Himnulitun er óbein mæling á lífvænleika.

Fyrir einfalt strok skaltu skipta um aðferð af varfærni

Kristalfjólublátt er hagnýtur valkostur þegar verkefnið er einlit skoðun á formgerð baktería. Bacteriological Analytical Manual frá FDA tilgreinir tvær samsetningar með kristalfjólubláu sem henta til einfaldrar litunar. Notaðu skjalfesta samsetningu og tilheyrandi undirbúningsaðferð; heiti litarefnisins eitt og sér skilgreinir ekki nothæft hvarfefni.

Kristalfjólublátt er einnig notað í Gram-litun, en það þýðir ekki að einföld litun með kristalfjólubláu sé Gram-litun. Í Gram-litunaraðferð ASM byggist mismunagreiningin á því að kristalfjólublátt, joð, aflitun og mótlitun verki í réttri röð. Ef þessum skrefum er sleppt breytist það sem hægt er að álykta af myndinni. Sjá einföld litun samanborið við Gram-litun fyrir þennan mun.

Nígrósín býður upp á aðra leið til að gera útlínur sýnilegar: það dekkir bakgrunninn á meðan bakteríufrumurnar haldast hlutfallslega ljósar. Í leiðbeiningum Merck um nígrósín er mikilvægt atriði sem almennur listi yfir staðgengla getur misst af. Tilgreind vinnusamsetning þess inniheldur formaldehýð. Því er ekki hægt að álykta um samhæfni við lifandi frumur út frá orðunum „neikvæð litun“, jafnvel þótt frumurnar sjálfar virðist ólitaðar. Athugaðu alla samsetninguna og undirbúning sýnisins.

Fyrir lifandi sýni skaltu íhuga að breyta ljósfræðinni

Ef þú vilt fylgjast með frumum hreyfast eða skipta sér getur notkun annars litarefnis flækt athugunina. Eins og Nikon útskýrir í leiðbeiningum sínum um birtuskil í gagnsæjum sýnum gera fasaskil og mismunatrufflunarskil, eða DIC, sýni sýnileg með mismun á ljósfræðilegum eiginleikum þeirra. Þessar aðferðir geta sýnt lifandi, ólitaðar frumur, að því gefnu að smásjáin hafi nauðsynlega íhluti.

Þetta val varðveitir ólitað sýni en breytir þeim upplýsingum sem fást. Hægt er að fylgjast með mörkum eða hreyfingu án þess að vita hvaða sameind olli birtuskilunum. Ef spurningin snýst um staðsetningu sameinda skaltu velja viðeigandi merkingaraðferð í staðinn.

Fyrir DNA í kjarna greinir samanburður Invitrogen á DAPI og Hoechst-litunum á milli algengrar notkunar DAPI með festum frumum og Hoechst 33342, sem fer auðveldara inn í frumur og er valið frekar til merkingar lifandi frumna. Bæði krefjast flúrljómunarbúnaðar. Hvorugt kemur beint í stað litaðrar bjartsviðslitunar.

Meðhöndlaðu útsetningu fyrir litarefni og lýsingu sem tilraunaskilyrði. Berðu saman lituð og ólituð sýni þegar hegðun frumanna er það sem þú mælir.

Rauð fruma er ekki sjálfkrafa dauð fruma

SYTO 9 og propidium iodide eru oft notuð saman til að meta heilleika frumuhimnu baktería. BacLight-handbókin tengir óskaddaðar himnur við græna litun og skaddaðar himnur við rauða litun. Þessa túlkun þarf að fullgilda fyrir viðkomandi sýni.

Rannsókn Rosenberg og samstarfsfólks frá 2019 sýnir vandann. Í 24-hour E. coli líffilmum á gleri í fosfatstuðpúðaðri saltlausn virtust um 96% frumna vera propidium-iodide-jákvæðar in situ. Höfundarnir áætluðu þó að 82% væru ræktanlegar eftir söfnun. Confocal-myndir sýndu frumur með grænt innra byrði undir rauðlituðu efni, sem benti til þess að utanfrumu-kjarnsýrur stuðluðu að villandi merkinu.

Þessar prósentur lýsa ólíkum mælingum á sýnum rannsóknarinnar en eru ekki almennur leiðréttingarstuðull. Gagnlegi lærdómurinn er að athuga hvað myndaði merkið. Í líffilmu getur kjarnsýrulitun greint efni utan frumna jafnt sem inni í sködduðum frumum. Til að draga ályktun um lífvænleika mæla rannsakendurnir með viðbótarmælingum, svo sem ræktun eða efnaskiptavirkni, jafnframt því að viðurkenna að hver aðferð hefur sínar takmarkanir.

Athugaðu hvað valkosturinn inniheldur í raun

Önnur litunaraðferð getur samt innihaldið metýlenblátt. Giemsa er dæmi: Merck lýsir vörunni sem azure-eosin-methylene-blue lausn, ætlaðri meðal annars fyrir blóð- og beinmergsstrok. Hún getur verið önnur aðferð fyrir annað sýni en uppfyllir ekki kröfu um að útiloka metýlenblátt.

Ef útilokun efnasambands er hluti af tilrauninni skaltu athuga auðkenni og samsetningu hvarfefnisins áður en myndir eru bornar saman. Leiðbeiningarnar um methyl blue, methylene blue og önnur litarefni með svipuð heiti fjalla um mun á heitum.

Staðfestu skiptin áður en niðurstaðan er notuð

Fyrir nýja aðferð skaltu gera lítinn samanburð með dæmigerðum sýnum og viðeigandi viðmiði. Haltu stillingum smásjárinnar sambærilegum þar sem það er mögulegt. Skráðu samsetningu hvarfefnisins, undirbúning sýnisins, útsetningu og myndgreiningarskilyrði svo hægt sé að rannsaka hvers vegna mynd lítur betur út í stað þess að velja hana eingöngu af útliti.

Metið árangurinn út frá upphaflegu spurningunni. Fyrir formgerð skaltu meta hvort frumumörk og uppröðun séu áfram túlkanleg. Fyrir kjarnamerkingu skaltu meta staðsetningu merkis og bakgrunn. Fyrir lífvænleika skaltu krefjast gagna umfram aðlaðandi litaskil. Í ítarlegri leiðbeiningum um litun með metýlenbláu og notkun á rannsóknarstofum er útskýrt hvernig athugunin og undirbúningurinn tengjast.

Veldu þann valkost sem varðveitir mælinguna sem þú þarft. Litur er aðeins einn eiginleiki myndarinnar sem fæst.