Paul Ehrlich og metýlenblátt: hvernig litarefni átti þátt í að móta leit að nýjum lyfjum

Framlag Pauls Ehrlich til læknisfræðinnar var ekki lyf. Það var röksemdafærsla um hvernig ætti að rannsaka lyf.

Árið 1878 lagði hann fram doktorsritgerð þar sem fyrsti hlutinn bar heitið „Efnafræðileg sýn á litun“. Þar hélt hann því fram að litun vefjasneiðar og litun efnisbúts fylgdu sömu rökum. Í báðum tilvikum festist liturinn vegna efnafræðilegrar sækni milli litarefnisins og efnisins, ekki vegna þess að vefurinn sé ídrægur, feitur eða lagaður þannig að hann fangi litarefni. Ehrlich hafði alist upp við að horfa á frænda sinn, meinafræðinginn Karl Weigert, útbúa litaðar vefjasneiðar. Það sem vakti áhuga hans voru ekki myndirnar heldur sú staðreynd að litarefnið valdi hvert það færi.

Fullyrðingin hljómar hófstillt. Það er hún ekki. Ef litarefni binst vef af efnafræðilegum ástæðum segir litunarmynstrið til um efnafræði þess vefs. Lituð sneið á smásjárgleri hættir að vera myndskreyting og verður mæling.

Hann byggði strax á þessu. Árið 1880 blandaði hann metýlenbláu við súrt fúksín og kallaði blönduna hlutlausan lit, neutralen Farbkörper. Með henni mátti greina á milli mismunandi tegunda hvítra blóðkorna, sem einstök litarefni í notkun á þeim tíma gátu ekki. Tveimur árum síðar kynnti hann aðferð til að lita berklabakteríur með metýlfjólubláu, og Koch tók aðferðina upp í eigin rannsóknum.

Kenningin sem síðar lagði sameiginlegan grunn að þessum aðferðum er annað mál, og tímasetning hennar er iðulega einfölduð um of. Hliðarkeðjukenning Ehrlichs, sú hugmynd að efni verki á frumu vegna þess að þau séu efnafræðilega samhæf, tilheyrir árunum eftir 1890, ekki árum litunartilraunanna. Fyrri rannsóknirnar lögðu til þá sannfæringu sem kom á undan: sértækni er efnafræðileg og því má leita að henni í stað þess að rekast á hana fyrir tilviljun.

Tilraunin sem breytti litarefninu í kort

Árið 1885 gaf Ehrlich út fræðirit um súrefnisþörf lífverunnar, með undirtitli sem lýsti því sem rannsókn með litgreiningu. Aðferðin fólst í að sprauta inn litarefnum sem breyta um lit eftir oxunarástandi og bera síðan saman hvernig ólík líffæri afoxuðu þau eða varðveittu. Litarefnið var notað sem mælitæki, líkt og hitamælir: það gaf upplýsingar um aðstæður inni í vefjum sem ekki var hægt að kanna beint. Ehrlich lýsti sjálfur markmiðinu sem því að ákvarða afoxunargetu lifandi líffæra með hjálp tiltekinna litarefna.

Niðurstaðan um metýlenblátt kom árið 1886, í grein um hvörf litarefnisins við lifandi taugavef, sem hafði verið lesin fyrir læknafélagi í desember árið áður. Metýlenblátt var sett í blóðrás lifandi dýrs og síðan voru þunnar vefjasneiðar fjarlægðar og látnar komast í snertingu við loft. Þannig oxaðist uppsafnað, litlaust litarefni aftur í blátt og sýndi hvar það hafði safnast fyrir. Taugafrumur og taugaþræðir tóku upp litinn, og sértæknin var næg til þess að tæknin varð viðtekin aðferð til að sýna taugavef. Efnasambandið var ekki lengur aðeins litarefni sem var borið á dauða vefjasneið á vinnuborði. Það var merki sem dreifðist innan lifandi líkama, og hægt var að lesa úr dreifingunni.

Eiginleikinn að baki báðum tilraununum þarf að koma skýrt fram, því allt annað í þessari sögu byggist á honum. Metýlenblátt getur gengið í gegnum afturkræf hvörf. Afoxað form þess, leúkómetýlenblátt, er litlaust og breytist aftur í bláu katjónina við snertingu við súrefni. Glúkósalausn með litarefninu í lokuðu íláti er litlaus; þegar ílátið er opnað verður hún blá. Greint er frá því að Ehrlich hafi sýnt þetta beint með því að meðhöndla litaðar sneiðar bæði með járnklóríði og lofti og fylgjast með litnum koma aftur. Litarefni sem breytir um lit eftir oxunar- og afoxunarástandi umhverfisins er rannsóknartæki fyrir það umhverfi.

Þannig stóðu tveir eiginleikar hlið við hlið. Litarefni gat greint einn vef frá öðrum. Og hægt var að kveikja og slökkva á litarefni með breytingu á oxunarástandi.

Sé horft til baka markar seinni eiginleikinn upphaf lyfjameðferðar með efnafræðilega völdum efnum. Ef efnasamband binst einni tegund vefjar en ekki annarri gæti sama efnasamband náð til einnar tegundar lífveru en ekki annarrar. Ehrlich setti ályktunina fram berum orðum: ef hægt væri að lita sýkil með sértækum hætti gæti litunin bent til sértækra skaðlegra áhrifa á þann sýkil. Litarefni gæti því nýst sem lyf sem beindist að innrásarvaldinu fremur en sjúklingnum.

Fyrsta prófunin á sjúklingi var ekki gegn malaríu. Árið 1890 greindi Ehrlich, ásamt geðlækninum Arthur Leppmann, frá því að metýlenblátt linaði verki tengda taugaverkjum og gigtarástandi í vöðvum, liðum og sinum. Þeir ræddu hvort lyfið gæti verkað á geðsjúkdóma og ákváðu að prófa það ekki. Ítalskur læknir, Pietro Bodoni frá Genúa, lét þó verða af því. Grein hans frá 1899 ber heiti sem vísar til róandi verkunar við ýmiss konar geðrof: hann lýsti róandi áhrifum hjá fjórtán órólegum sjúklingum og tók fram að aðrir læknar í Genúa væru þegar farnir að nota litarefnið í sama tilgangi. Róandi áhrif eru ekki áhrif á sjúkdóminn sjálfan, og þessi greinarmunur birtist aftur og aftur í þessari sögu.

Malaríurannsóknin fór fram árið 1891, með meinafræðingnum Paul Guttmann, á Moabit-sjúkrahúsinu í Berlín. Tveimur sjúklingum var gefið metýlenblátt og skýrslan birtist í Berliner klinische Wochenschrift 28. september 1891. Í fyrra tilvikinu tók sjúklingurinn 0.5 g af litarefninu í einu að kvöldi 29. júní; kastið sem búist hafði verið við kom ekki fram að fullu og eina kvörtunin sem var skráð eftir það var væg þvagtregða með verkjum og bláu þvagi. Hitaköstin hurfu á fyrstu dögunum og sníkjudýrin voru horfin úr blóðinu í síðasta lagi á áttunda degi. Í eigin samantekt sögðu höfundarnir að væntingar þeirra hefðu ræst að fullu. Tvö tilvik án samanburðarhóps eru ekki sönnun. Ítarlegri umfjöllun um metýlenblátt og malaríu, þar á meðal nútímarannsóknirnar, á heima á sérstakri síðu. Spurningin sem hér er áhugaverð er afmarkaðri: hversu mikið af röksemdafærslu Ehrlichs stóðst þegar hún mætti sníkjudýrinu.

Hvar rökin héldu og hvar þau brugðust

Ekki mikið af skýringunni á verkunarhættinum stóðst, að minnsta kosti ekki í þeirri mynd sem Ehrlich lagði til. Snyrtilega útgáfan, þar sem flöt þríhringlaga katjón smýgur milli basapara í DNA sníkjudýrsins, stenst ekki þegar Plasmodium á í hlut. Metýlenblátt afoxast svo auðveldlega í sýktu rauðu blóðkorni að það berst aldrei til sníkjudýrsins sem flöt katjón. Skýringin um innskot milli basapara, sem á við akrídínlitarefni, á ekki við þetta litarefni.

Það sem gögnin styðja er flóknara. Metýlenblátt hamlar glútaþíonredúktasa sníkjudýrsins við styrk sem hægt er að ná hjá sjúklingi. Það hindrar umbreytingu hems í hemózóín, óvirka litarefnið sem sníkjudýrið myndar til að forðast eitrun vegna eigin niðurbrots á hemóglóbíni, um það bil jafn vel og klórókín og mun betur en kínín. Oxunar- og afoxunarhringrás þess myndar einnig hvarfgjarnar súrefnistegundir í frumu sem er þegar að framleiða þær. Enn er óútkljáð hver þessara leiða sé hinn raunverulegi verkunarháttur, eða hvort þær eigi allar þátt í honum.

Annað flækir málið og ætti að móta hvernig sögulegar fullyrðingar um þetta efnasamband eru lesnar. Metýlenblátt sem var selt á þessum tíma var ekki eitt efni. Sýni innihéldu azure B, skylt efnasamband með einum metýlhópi færra, og meira af því safnaðist fyrir í eldri lausnum. Azure B er litarefni sem sýnir metakrómasíu og hefur önnur bindiset: það litar tvíþátta DNA djúpblátt og RNA grænt. Blanda tveggja litarefna sem leita á ólíka staði, í hlutföllum sem enginn skráði, getur ekki stutt skýra fullyrðingu um hvað metýlenbláa efnið í henni gerði.

Litarefnið sjálft leysti kínín aldrei af hólmi. Aðferðinni vegnaði betur. Wilhelm Roehl, nemandi Ehrlichs, starfaði hjá litarefna- og lyfjasamsteypunni IG Farben. Hann hélt áfram að þróa afleiður litarefna sem lyf við hitabeltissjúkdómum og lagði til verkfærið sem vantaði: kanarífugl sýktur af fuglamalaríu sem staðlað skimunarlíkan fyrir vænleg efnasambönd. Werner Schulemann breytti síðan hliðarkeðjunni og fenótíazíníumsaltið sem varð til læknaði tilraunasýkinguna. Það litaði sjúklinga þó enn bláa.

Það sem stóðst tímans tönn reyndist hvorki vera litarefnið né hringkerfið, heldur hliðarkeðjan. Með því að bæta við díalkýlamínóalkýlamínóhópi breyttust eiginleikar sameindarinnar, og sá hluti lifði allar síðari breytingar á gerð hennar. Ef hópnum er haldið en fenótíazíníumhringnum skipt út fyrir akrídín verður niðurstaðan kínakrín. Sé kínólín sett í staðinn verður niðurstaðan klórókín. Pamakín, prímakín og amódíakín, sem öll eru enn á skrá yfir malaríulyf, bera sama hóp. Efnasambandið sem brást sem meðferð lagði til þann hluta sem náði árangri.

Tengslin við geðrofslyfin liggja í gegnum hringinn fremur en lyfið. Það var greining á byggingu metýlenblás sem leiddi Heinrich August Bernthsen að grunnkjarna fenótíazíns árið 1883. Efnafræðingar hjá Rhône-Poulenc unnu með þessa grunnbyggingu, með mismunandi tengihópum, á árunum eftir 1940 í leit að andhistamínlyfjum. Eitt þessara efnasambanda var framleitt með efnasmíði undir lok árs 1950 og prófað af skurðlækninum Henri Laborit, sem tók eftir því að það gerði sjúklinga rólega og afskiptalausa. Fyrsta birta lýsingin á notkun þess í geðlækningum, hjá sjúklingi með oflæti, kom í janúar 1952. Fyrsta geðrofslyfið er því síður afkomandi malaríulyfs Ehrlichs en fjarskyldur ættingi litarefnisins sem hann byrjaði með.

Þrjár starfsvenjur sem vert er að varðveita úr þessari sögu

1. „Fyrsta tilbúna lyfið sem var notað í læknisfræði“ lýsir flokki, og fyrirvararnir eru stærri en orðalagið gefur til kynna. Orðalagið er orðið fast í sessi; yfirlitsgrein eftir Schirmer og samstarfsfólk, sem oft er vitnað í, í Neurobiology of Aging kallar metýlenblátt allra fyrsta lyfið sem var að fullu framleitt með efnasmíði og notað í læknisfræði. Klóralhýdrat var tekið í notkun sem tilbúið róandi lyf árið 1869, meira en tuttugu árum fyrr. Greinin frá 1891 veitir sjálf hluta svarsins, því höfundarnir nefna tilbúin hitalækkandi lyf sem höfðu þegar brugðist gegn malaríu, þar á meðal kínólín, antípýrín og antífíbrín. Arsenlyf Ehrlichs sjálfs gegn sárasótt kom enn síðar. Verjanleg útgáfa fullyrðingarinnar snýst um aðferð fremur en forgang: metýlenblátt er meðal fyrstu tilbúnu efnasambandanna sem voru valin til að verka gegn tiltekinni lífveru á grundvelli efnafræðilegrar kenningar um sértækni.
2. Sértæk dreifing er ekki sértækur ávinningur. Niðurstaða Ehrlichs frá 1886 var að litarefnið leitaði í taugavef. Hvert efnasamband fer og hvað það gerir þegar þangað er komið eru tvær ólíkar mælingar, og sú fyrri er mun auðveldari í framkvæmd. Flestar fullyrðingar um metýlenblátt og heilann hafa síðan byggst á því bili.
3. Hreinleiki er hluti af sönnunargögnunum, ekki markaðssetningunni. Sögulegu heimildirnar eru óljósar einmitt af þessari ástæðu. Smávægilegur munur á byggingu breytir því hvert þetta efnasamband fer. Þess vegna verður greiningarvottorð að tengjast tiltekinni framleiðslulotu en ekki vera sett fram sem almenn yfirlýsing um að vara sé prófuð. Söluaðili sem segist uppfylla kröfur sérgreinar í lyfjaskrá en prófar aðeins þungmálma fullyrðir meira en skýrslan styður. Blupreme fær metýlenblátt frá lyfjaframleiðanda og prófar samkvæmt öllum gæðakröfum sérgreinarinnar: auðkenningu, hreinleika, lífrænum óhreinindum, leifum leysiefna, óhreinindum úr frumefnum, glæðileifum, örverumörkum og innrænum eiturefnum baktería. Skýrslan er birt með vörunni, og síðan um metýlenblátt af USP-gæðum útskýrir þessi mörk og hvers vegna niðurstaðan fyrir azure B er sú fyrsta sem ætti að leita að.

Tímasett heimildaslóð

Tímaröð þessara áfanga, þar á meðal efnafræði litarefnanna sem kom á undan Ehrlich og gæðaflokkarnir og gæðakröfurnar sem komu á eftir honum, er sett fram sérstaklega í sögu metýlenblás. Fjallað er um auðkenni efnasambandsins sjálfs í greininni um hvað metýlenblátt er.

Myndsíðurnar að baki þessari frásögn, sem eru endurbirtar í yfirlitsgrein Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania frá 2012, hafa ekki sama heimildagildi, og eitt dæmi sýnir hvers vegna. Myndsíðan frá 1891 er frumheimild um rannsóknina; mannamyndin frá 1910 við hlið hennar tímasetur orðspor og ekkert annað. Síður úr minnisbók Andersags frá 1934 eru bein ummerki um skiptin yfir í kínólín, með eigin rithönd efnafræðingsins.

Heiðarleg samantekt á litarefnatilraunum Ehrlichs er að hann hafði rétt fyrir sér um sértæknina og markið, en rangt fyrir sér um verkunarháttinn. Metýlenblátt safnast vissulega fyrir í taugavef og skaðar vissulega malaríusníkjudýrið. Það gerir ekki hið síðara vegna hins fyrra, og efnafræðilega skýringin sem hann gaf á hvoru tveggja var röng. Það sem hann sýndi svo ekki varð um deilt var varanlegra en réttur verkunarháttur: hægt er að velja efnasamband fremur en að finna það fyrir tilviljun, og velja það á grundvelli gagna sem er aflað áður en nokkur gefur það sjúklingi.