Getur metýlenblátt farið fram hjá fléttu III í hvatberum? Hvers vegna ber rannsóknum ekki saman

Tvær rannsóknarstofur spurðu hvort metýlenblátt gæti farið fram hjá hindraðri fléttu III í hvatberum. Önnur svaraði nei. Hin svaraði já. Báðar höfðu gögn því til stuðnings.

Fyrri rannsóknin, á hvatberum úr músaheilum, sýndi að litarefnið gæti það ekki. Sú síðari, á heilahvatberum úr þremur nagdýrategundum, sýndi að það gæti það að hluta. Oft er vitnað samhliða í þriðju rannsóknina, á músalifur, en þar var annað prófað. Ef henni er haldið í réttu samhengi hverfur helmingur ruglingsins.

Hér er enginn algildur verkunarháttur til að kynna. Hér eru þrjár tilraunir með ólíka hemla, skammta og mæliþætti. Skoðaðu aðstæðurnar fyrst. Niðurstöðurnar fylgja af þeim.

Hvað hjáleið merkir hér

Rafeindir fara inn í keðjuna um fléttu I (frá NADH) eða fléttu II (frá súksínati), berast um fléttu III til cýtókróms c og síðan um fléttu IV til súrefnis. Stigullinn sem myndast á leiðinni er það sem fruman nýtir til að mynda ATP.

Fullyrðing um hjáleið felur í sér að metýlenblátt taki við rafeindum fyrir hindrunina og afhendi þær handan hennar. Oxað litarefnið tekur við rafeindum frá NADH eða fyrstu þáttum keðjunnar og verður að leúkómetýlenbláu. Afoxaða formið afhendir þær síðan cýtókrómi c eða skilar þeim aftur inn í keðjuna. Ef afhendingin á sér stað handan hindrunarinnar endurheimtast öndun og himnuspenna að hluta. Ef hún á sér stað við hindrunina eða fyrir hana endurheimtist hvorugt.

Eitt atriði í starfsemi fléttu III ræður miklu um þennan ágreining. Fléttan starfar með Q-hring sem hefur tvo bindistaði fyrir hemla. Antimýsín binst Qi-staðnum. Mýxóþíasól binst Qo-staðnum. Rannsókn sem notar aðeins annan þeirra hefur aðeins prófað helming fléttunnar.

Rannsókn eitt: engin hjáleið í heilahvatberum músa

Gureev og samstarfsfólk notuðu hvatbera úr heilaberki C57BL/6 músa, einangraða með dígítóníni, og mældu þá við próteinstyrkinn 0.1 mg á ml. Hvarfefnin voru notuð við þrenns konar aðstæður: pýrúvat ásamt malati, hvort um sig við 5 mM, súksínat við 10 mM ásamt glútamati við 2 mM og L-prólín við 10 mM. Hemlarnir voru rótenón við 1 micromolar (flétta I) og antimýsín við 1 microgram á ml (flétta III). Skammtar litarefnisins voru 0.5, 1 og 2 micromolar, en 1 micromolar var aðalstyrkurinn. Aðferðir og mælingaferlar eru í greininni í FEBS Letters.

Hjáleið fram hjá fléttu I virkaði. Rótenón dró úr öndun örvaðri af ADP úr um 121 niður í um 2 nmol á mínútu á mg, og litarefni við 1 micromolar jók hana aftur í um 21. Himnuspenna endurheimtist með pýrúvati ásamt malati og með L-prólíni.

Hjáleið fram hjá fléttu III virkaði ekki. Antimýsín dró úr öndun niður í um 16, og litarefnið jók hana aðeins í um 20. Himnuspenna endurheimtist ekki með neinu hvarfefni, jafnvel við litarefnisskammta allt að 5 micromolar. Gögn um peroxíð bentu í sömu átt: litarefnið eitt og sér jók losun peroxíðs úr grunnstigi nálægt 76 pmol á mínútu á mg í um 1170, 1460 og 1945 við skammtana þrjá. Antimýsín dró þó úr þessum litarefnisdrifna mælingum um um það bil 25, 88 og 96 prósent, í sömu röð. Ef afoxað litarefni hvarfaði beint við súrefni ætti hindrun fléttu III ekki að bæla mæligildið. Höfundarnir ályktuðu að afoxað litarefnið væri oxað á Qo-stað fléttu III, fyrir antimýsínhindrunina. Stutta lykkjan í orðum: rafeindagjafar til litarefnis, litarefni til Qo, síðan hefðbundin leið áfram. Farið er fram hjá rótenóni. Ekki er farið fram hjá antimýsíni.

Rannsókn tvö: hjáleið að hluta í þremur tegundum, við báða bindistaði hemla

Svab og samstarfsfólk víkkuðu tilraunasniðið. Þau notuðu heilahvatbera úr músum, rottum og naggrísum, einangraða með Percoll, og mældu við sama styrk, 0.1 mg á ml, með pýrúvati ásamt malati eða glútamati ásamt malati, hverju efni við 5 mM. Þau notuðu tvo hemla fyrir fléttu III: antimýsín A við 0.3 micromolar og mýxóþíasól við 1 micromolar. Litarefnið var við 2 micromolar í flestum mælingum og 0.5 í mælingum á cýtókrómi c. Allar þrjár tegundirnar, rannsakaðar með sambærilegum aðferðum, eru í greininni með opnum aðgangi.

Farið var að hluta fram hjá báðum hindrunum í öllum þremur tegundunum. Í músahvatberum bældi antimýsín öndun og litarefnið jók hana um 60 prósent, úr um 37 í 59 nmol á mínútu á mg. Mýxóþíasól bældi hana um 88 prósent, niður í um 4.5, og litarefnið jók hana fimmfalt í um 23. Himnuspenna endurheimtist að hluta með hvorum hemli sem var. Hún var mæld með tveimur litarefnum (safraníni O og hlutfallsmælingu með TMRM) til að útiloka sjónrænar mæliskekkjur.

Í þessari rannsókn var rafeindaafhendingin einnig prófuð beint, sem var aldrei gert í fyrri rannsókninni. Utanaðkomandi asetýlerað cýtókróm c við 25 micromolar var ekki afoxað af hvatberum með virka orkuvinnslu, hvort sem hemlar voru til staðar eða ekki. Viðbót litarefnis olli hins vegar afoxun í báðum tilvikum. Í frumulausri stuðpúðalausn afoxuðu NADH og litarefnið saman cýtókróm c á hraða sem var í hlutfalli við NADH. Lengra stökkið í orðum: afoxunarígildi til litarefnis, litarefni beint til cýtókróms c, flétta IV til súrefnis. Sú leið sleppir fléttu III alfarið, svo hægt er að fara fram hjá báðum hemlunum.

Tveir mæliþættir til viðbótar styðja þessa túlkun. Flúrljómun NAD(P)H minnkaði þegar litarefni var bætt við hvatbera sem höfðu verið meðhöndlaðir með mýxóþíasóli. Það merkir að afoxunarígildi streymdu eftir nýju leiðinni. Auk þess fylgdi gleypni litarefnis við 660 nm hverri viðbót fyrir sig. Mælingar á flotvökva eftir skilvindun sýndu að oxað litarefni safnaðist meira en hundraðfalt upp inni í hvatberum með virka orkuvinnslu og fór síðan út þegar himnuspennan hrundi. Róteindabókhaldið passar líka: þegar dælingarskrefunum er sleppt verða eftir um 2 róteindir á hvert rafeindapar í stað 10. Hraðari súrefnisnotkun ásamt aðeins hlutaendurheimt himnuspennu er því einmitt það sem raunveruleg hjáleið lítur út eins og, ekki vísbending gegn henni.

Í sama hvatberaundirbúningi komu fram viðbrögð sem sýna hættuna við yfirborðslegan lestur. Með hemli og litarefni dró ADP úr öndun í stað þess að auka hana, og hindrun flutnings örvaði hana í stað þess að hægja á henni. Himnuspennan breyttist þó enn í venjulegar áttir. Súrefnisnotkun ein og sér gefur villandi mynd í þessu kerfi.

Rannsókn þrjú: lifrarrannsóknin sem prófaði fléttur I og II, ekki III

Lee og Boelsterli notuðu hvatbera úr músalifur og ræktaðar lifrarfrumur sem höfðu skaðast af efavírenzi (flétta I, IC50 nálægt 30 micromolar) og hýdrasíni, umbrotsefni ísóníasíðs (flétta II, IC50 nálægt 30 micromolar). Litarefni við um 30 micromolar endurheimti oxun NADH, himnuspennu og ATP, um leið og það dró úr oxandi efnum og frumudauða vegna dreps. Í greininni í Redox Biology er þetta skýrt með líkani þar sem litarefnið flytur rafeindir fram hjá sködduðum fléttum I og II.

Sú niðurstaða er staðfest samhengi ofar í keðjunni. Hún segir ekkert um fléttu III því þar var ekkert hindrað. Hún getur hvorki staðfest né hrakið aðra hvora heilarannsóknina.

Samanburðartafla aðstæðna

Fjórar ástæður fyrir því að báðar rannsóknir á fléttu III geta verið réttar við sínar aðstæður

1. Hemlarnir fólu ekki í sér sama inngrip. Antimýsín eitt og sér við 1 microgram á ml annars vegar, og antimýsín við 0.3 micromolar ásamt sérstökum hemli fyrir Qo-staðinn hins vegar. Leið þar sem litarefnið afhendir rafeindir á Qo-staðinn bregst einmitt þar sem bein leið til cýtókróms c virkar. Einn bindistaður getur ekki komið í stað beggja.

2. Skammtur litarefnis og tímasetningar voru ólík. Aðalstyrkurinn var 1 annars vegar og 2 micromolar hins vegar. Litarefnið gengur í gegnum oxunar-afoxunarhringi, og bæði upptaka þess og bein afoxun cýtókróms c eru háðar styrk og tíma. Lítill skammtamunur ásamt ólíkum mælitíma getur dregið fram mismunandi hluta sama flutningsnets.

3. Undirbúningurinn var ólíkur. Einangrun með dígítóníni annars vegar og með Percoll-stigli hins vegar velur hvatberahópa sem skarast en eru ekki alveg eins. Próteinstyrkurinn var sá sami, 0.1 mg á ml, svo sú breyta fellur út, en undirhópar og ástand hvatberanna gera það ekki. Tegundamunur var líka útilokaður sem skýring: síðari hópurinn endurtók sama svipgerðarmynstur í músum.

4. Hvarfefnaaðstæður ráða því hvað litarefnið getur gert. Þrenns konar hvarfefnaaðstæður annars vegar og NADH-tengd hvarfefnapör hins vegar. Framboð NADH og himnuspenna ráða saman hversu hratt litarefnið afoxast og hvar það dreifist. Leið sem þarfnast afoxaðs litarefnis við hlið oxaðs cýtókróms c er háð því vali.

Hvernig á að lesa næstu fullyrðingu um hjáleið

Spyrðu hvaða flétta var hindruð, með hvaða hemli, á hvaða bindistað og við hvaða skammt. Spyrðu um styrk litarefnisins og hvenær mælingin var gerð. Spyrðu um vef, tegund, einangrun, próteinstyrk og hvarfefni. Spyrðu líka hvort himnuspenna, öndun, oxunar-afoxunarástand og bein mæling á rafeindaafhendingu séu samhljóða, því súrefnisnotkun ein og sér gaf hér oftar en einu sinni ranga mynd.

Afmarkaða samantektin stendur. Samstaða er um hjáleið litarefnis fram hjá fléttu I. Hvað fléttu III varðar sýna músahvatberar með antimýsíni við 1 microgram á ml og litarefni við 1 micromolar enga virka hjáleið. Þrjár tegundir með antimýsíni við 0.3 micromolar eða mýxóþíasóli við 1 micromolar og litarefni við 2 micromolar sýna hins vegar hjáleið að hluta, með beinum flutningi frá litarefni til cýtókróms c. Þessar setningar geta báðar verið réttar. Allt víðtækara er ályktun út fyrir gögnin.

Tengt lesefni heldur umdeildu fullyrðingunni innan ramma óumdeildrar efnafræði: hvernig metýlenblátt flytur rafeindir um rafeindaflutninginn, tilraunirnar á hjáleið fram hjá fléttu I um staðfesta tilfellið ofar í keðjunni, mælingar á himnuspennu og mæliskekkjur þeirra um hvers vegna tvö litarefni þurfti, og meðhöndlun efna sem ganga í gegnum oxunar-afoxunarhringi á rannsóknarstofu um gildrur tengdar skömmtum og tímasetningum.