Metýlenblátt og ferroptósa: ferli lípíðperoxunar

Ferroptósa er frumudauði af völdum himnuskemmda. Fjölómettuð fita í himnum oxast í keðjuhvarfi, himnan bregst og fruman deyr. Járn er nauðsynlegt fyrir efnahvörfin. Þessi lýsing nær yfir hugmyndina í heild og allt í þessari grein er prófun á einhverjum hluta hennar.

Spurningin hér er afmarkaðri: hvað gerir metýlenblátt við þessa keðju í frumutilraunum og hvað sýna niðurstöðurnar í raun? Stutta svarið er að í tveimur rannsóknarstofurannsóknum dró metýlenblátt í nanómólarstyrk úr lípíðperoxun í hvatberum og hélt frumum lifandi eftir áreiti sem annars valda ferroptósu. Lengra svarið skiptir meira máli, því hver hlekkur keðjunnar var prófaður með ólíku inngripi og hvert inngrip hefur sínar takmarkanir.

Ferroptósa í einni málsgrein

Fosfólípíð í himnu sem ber fjölómettaða fitusýrukeðju hefur veikan blett: vetnisatóm sem auðvelt er að hrifsa burt. Þegar sindurefni hefur hrifsað eitt þeirra bindst súrefni lípíðinu, peroxýlsindurefni lípíðs myndast og það sindurefni hrifsar vetni frá næsta lípíði. Hvarfið breiðist út eftir himnunni nema eitthvað stöðvi það.

Helsta stöðvunarkerfið er ensím sem kallast GPX4 og notar glútatíon til að afoxa lípíðperoxíð í skaðlaus lípíðalkóhól. Áreiti á rannsóknarstofu ráðast á þessar varnir á afmörkuðum stöðum. Erastin hindrar innflutning cystíns um kerfið xc-mínus og sviptir þannig frumuna cysteini til glútatíonmyndunar. Buthionine sulfoximine hindrar glútatíonmyndun beint. RSL3 hindrar sjálft GPX4. Öll þrjú valda því að peroxíð eru ekki fjarlægð, en þau gera það á mismunandi stigum. Því gildir niðurstaða með einu áreiti ekki sjálfkrafa um hin.

Ferroptósa er frábrugðin apoptósu hvað varðar þau einkenni sem skilgreina hana. Engin kaspasakeðja verður og engir apoptósuhlutar myndast. Járnklóbindandi efni eins og deferoxamine og efni sem fanga sindurefni, svo sem ferrostatin-1, bæla hana. Þetta er hagnýta prófið sem rannsakendur nota til að greina frumudauða sem ferroptósu fremur en eingöngu drep. Víðara samhengi stýrðra frumudauðaferla skýrir þennan mun og meðhöndlun frumna á hvarfgjörnu járni skýrir hvers vegna klóbinding er svo afgerandi samanburðarpróf.

Hlutverk hvatbera og hvers vegna það var umdeilt

Fyrstu rannsóknir greindu frá því að frumur án hvatbera-DNA gengju samt í gegnum ferroptósu, sem benti til þess að hvatberar væru ekki nauðsynlegir. Síðari rannsóknir sýndu að fækkun hvatbera eða hömlun frumuöndunar getur bælt ferroptósu af völdum cysteinskorts en ekki af völdum beinnar GPX4-hömlunar. Báðar niðurstöður geta verið réttar ef framlag hvatbera fer eftir áreitinu, frumugerðinni og því hvar afgerandi peroxunin á sér stað.

Rannsóknin sem þessi grein byggist á nálgaðist ágreininginn með mælinema sem beinist að ákveðnu frumuhólfi. MitoCLox er hvatberamiðuð útgáfa af mælinema fyrir lípíðperoxun: flúrljómun hans breytist þegar hann kemst í snertingu við peroxýlsindurefni lípíða inni í hvatberum. Í bandvefsfrumum sem voru meðhöndlaðar með erastin sást oxun hvatberanemans í enn lifandi frumum áður en þær dóu og hún var mismikil innan frumuhópsins. Þessi tímasetning skiptir máli. Peroxun sem kemur á undan frumudauða er möguleg orsök. Peroxun sem mælist aðeins í dauðum frumum er eftirköst. Í meðfylgjandi leiðarvísi um mælingar á lípíðperoxun og hvað hver mælinemi sýnir er fjallað um hvers vegna staðsetning nemans ræður merkingu mæligildisins.

Sama mynstur kom fram í öðru líkani. Bandvefsfrumur frá sjúklingi með arfgengan sjóntaugakvilla Lebers, sem bera stökkbreytingu í fléttu I og hafa meira oxunarálag í grunnástandi, dóu af völdum ferroptósu þegar glútatíon var þurrkað upp, en samanburðarbandvefsfrumur stóðust áreitið. Oxun hvatberanemans kom aftur fyrst. Nánari upplýsingar má finna í rannsókninni á lípíðperoxun í hvatberum við ferroptósu í bandvefsfrumum.

Hverju metýlenblátt breytti í þessum tilraunum

Metýlenblátt er rafeindaberi í oxunar- og afoxunarhvörfum. Oxað form þess tekur við rafeindum úr NADH-tengdum efnahvörfum við fléttu I og afoxað form þess afhendir þær cýtókrómi c, sem flytur þær áfram til fléttu IV. Þannig myndast hjáleið að hluta fram hjá þeim hluta keðjunnar þar sem rafeindir leka venjulega til súrefnis og mynda súperoxíð. Lesendur sem vilja fá heildarmynd af þessum flutningi ættu að byrja á því hvernig metýlenblátt flytur rafeindir um hvatbera.

Í lungnabandvefsfrumum sem voru meðhöndlaðar með erastin varðveitti metýlenblátt við 250 nanómólar lífvænleika samkvæmt mælingu á lifun frumna, líkt og hvatberamiðuðu andoxunarefnin SkQ1 og MitoTEMPO. Samanburðartilraunirnar afmarka fullyrðinguna. Ferrostatin-1, alfa-tókóferól og deferoxamine veittu einnig vernd, sem staðfestir að frumudauðinn var ferroptósa. Hliðstæða SkQ1 án andoxunarhóps veitti enga vernd, sem bendir til oxunar- og afoxunarhvarfa fremur en ósértækrar uppsöfnunar. Verndin dvínaði þegar styrkur SkQ1 fór yfir um það bil 200 nanómólar, í samræmi við þekkta oxunarhvetjandi hegðun kínónandoxunarefna við meiri styrk. Metýlenblátt sýnir sömu tvíþættu styrkháðu hegðun: það veitir vernd við lágan nanómólarstyrk í þessum ræktunarskálum en getur myndað vetnisperoxíð með endurteknum oxunar- og afoxunarhvörfum við meiri styrk eða sterka lýsingu. Fjallað er um slíkt styrksamhengi í greininni um hvarfgjarnar súrefnistegundir í hvatberum.

Tilraunirnar með einangraða hvatbera aðgreindu síðan uppsprettur hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS). Þegar tvígilt járn var til staðar örvuðu hvarfefni sem fæða fléttu I, ásamt rotenone, oxun mælinemans. Rotenone hindrar rafeindaflutning neðan við flavínsetið, þannig að rafeindaberar ofar í keðjunni haldast afoxaðir og rafeindir leka til súrefnis frá flavíninu sem snýr að hvatberafylkinu. Hvarfefni sem fæða fléttu III, ásamt antimycin A, mynduðu mikið vetnisperoxíð en knúðu ekki lípíðperoxun. Sama heildarmerki um ROS, ólík staðsetning, ólík niðurstaða. Bæði SkQ1 og metýlenblátt bældu peroxunina sem flétta I knúði án þess að bæla sjálfa vetnisperoxíðmyndunina. Það staðsetur verkun þeirra eftir myndun ROS, á stigi lípíðperoxunar.

Rannsóknarhlutinn um járnofhleðslu og vísbendingin frá lípófúskíni

Önnur rannsókn nálgaðist spurninguna frá járnhliðinni. Í H9c2-hjartavöðvafrumum sem voru útsettar fyrir járn(III)-ammóníumsítrati í styrk undir millimólarstigi mynduðust ROS í hvatberum, síðan varð lípíðperoxun í hvatberum og loks ferroptósa, sem fylgt var eftir með uppsöfnun lípófúskínlíks litarefnis innan 24 klukkustunda. Lípófúskín er sjálfflúrljómandi, járninnihaldandi leif oxaðra lípíða og próteina sem safnast upp með aldri. Hröð myndun þess hér tengir bráða járndrifna peroxun við hefðbundið öldrunarmerki. Metýlenblátt í nanómólarstyrk og SkQ1 komu bæði í veg fyrir peroxunina, frumudauðann og uppsöfnun litarefnisins. Einangraðir hjartahvatberar staðfestu mynstrið: rotenone ásamt tvígiltu járni knúði peroxun og merki sem líktist litarefni og bæði efnin stöðvuðu það. Öllu ferlinu er lýst í rannsókninni á járnofhleðslu í H9c2-hjartavöðvafrumum. Litarefnishlið málsins á heima með umfjöllun um lípófúskín og merki frumuöldrunar.

Hvað mælingar á lifun frumna sýna ekki

Lífvænleikamæling á borð við CellTiterBlue sýnir hversu margar frumur í ræktunarskál halda efnaskiptavirkni eftir áreiti ásamt efni sem hugsanlega veitir vernd. Þetta er prófun á verkunarferli í skilgreindu kerfi. Hún er ekki niðurstaða meðferðar. Í engri þessara tilrauna var sjúklingi gefið efnið, mældur endapunktur sjúkdóms eða ákvarðað meðferðarbil í líkama.

Fjórar takmarkanir þarf að taka skýrt fram. Í fyrsta lagi eru frumugerðirnar fáar: umbreyttar lungnabandvefsfrumur, frumrækt af húðbandvefsfrumum, þar á meðal ein frumulína með hvatberasjúkdóm, og hjartavöðvafrumulína úr rottu, auk einangraðra hvatbera úr rottuhjörtum. Næmi var mismunandi eftir frumulínum og LHON-línan var valin vegna þess að hún var sérstaklega viðkvæm. Í öðru lagi eru áreitin öfgakenndar rannsóknarstofuaðstæður: algjör hömlun á flutningi eða myndun efna og járnálag sem enginn vefur yrði fyrir með svo skyndilegum hætti. Í þriðja lagi er ekki hægt að yfirfæra styrk með einfaldri margföldun. Nanómólarstyrkur í ræktunaræti er ekki skammtur fyrir mann. Dreifing metýlenblás, afoxun þess í litlaust form í blóði og vefjum, ljósútsetning og himnuspennan standa öll á milli ræktunarskálar og manneskju. Í fjórða lagi sýna mælinemarnir aðeins það sem gerist í sínu frumuhólfi. Oxun MitoCLox sýnir að sindurefni lípíða hafi myndast í hvatberum. Hún sýnir ekki að komið hafi verið beint í veg fyrir rof frumuhimnunnar, sem er líklega lokaatburðurinn, fremur en að það hafi verið forðað með inngripi fyrr í ferlinu.

Heiðarlega fullyrðingin er því þessi: í þessum líkönum knýja ROS frá fléttu I ásamt járni lípíðperoxun í hvatberum sem kemur á undan ferroptósu og metýlenblátt í lágum styrk rýfur þann hluta ferlisins. Allt sem nær út fyrir þann hluta krefst annarra tilrauna í dýrum og síðan í fólki.