Hvers vegna gleypni metýlenblás breytist með styrk

Taktu eina flösku af stofnlausn metýlenblás og helltu í tvö glös. Fylltu fyrra glasið með stofnlausninni og hið síðara með tífalt þynntri lausn. Síðara glasið er ljósara, eins og búast má við. Við nánari skoðun sést að annað hefur líka breyst. Litblærinn hefur hliðrast. Önnur lausnin er fremur heiðblá en hin blá með fjólubláum blæ. Þynningin gerði meira en að draga úr litstyrk. Hún breytti því hvaða efnaform gleypir mest af ljósinu.

Hugmyndin að baki þessari hliðrun er einföld. Uppleyst metýlenblátt er ekki aðeins eitt efnaform. Stök litarefniskatjón, kölluð monómer, getur staflast flöt við flöt við aðra katjón og myndað dímer. Dímerar geta síðan myndað stærri þyrpingar. Hvert form hefur sitt eigið gleypniróf. Það sem litrófsmælir sýnir er samanlagt framlag allra efnaforma í mælikerinu við þær aðstæður sem þar ríkja. Breyttu blöndunni og litrófið hliðrast, jafnvel þótt heildarmagn litarefnis fylgi einföldu þynningarhlutfalli.

Monómerar og dímerar gleypa ljós á ólíkan hátt

Ímyndaðu þér monómerinn sem flatt spjald með jákvæða hleðslu dreifða yfir hringjakerfi sitt. Tvö slík spjöld geta legið flöt við flöt. Jákvæðu hleðslurnar hrinda hvor annarri frá sér, en sléttu arómatísku yfirborðin dragast hvort að öðru vegna stöflunarvíxlverkana. Vatnið og mótjónirnar í kring skýla jafnframt hleðslunum og draga úr fráhrindingunni. Niðurstaðan er bundið par með sameiginleg rafeindaástand. Leyfðar færslur þess eru við hærri orku en færsla monómersins, þannig að gleypniband dímersins birtist við styttri bylgjulengd en band monómersins. Stærri þyrpingar leggja enn frekar til gleypni bláum megin sem öxl á rófinu.

Við mjög lágan styrk í hreinu vatni eru monómerar ríkjandi og langbylgjubandið er ráðandi. Þegar heildarstyrkur hækkar verður hlutfall paraða formsins sífellt stærra og stuttbylgjubandið vex miðað við hið fyrra. Hlutfall bandanna tveggja segir því til um samsetningu blöndunnar, ekki beint um heildarstyrkinn. Mæling við eina bylgjulengd getur ekki greint þar á milli nema gert sé ráð fyrir því hvaða form sé til staðar.

Þess vegna verða viðmiðunarróf alltaf að fylgja upplýsingum um aðstæður. Í litrófsviðmiðun fyrir metýlenblátt eru staðsetningar banda settar í töflu ásamt leysi, saltinnihaldi, pH, hitastigi og styrkbili sem þau voru mæld við. Ef toppur er tilgreindur án þessara aðstæðna er talan ekki nægilega skilgreind. Tvær rannsóknarstofur geta báðar haft rétt fyrir sér um ólík litróf sama litarefnis, því þær mældu ólíkar blöndur.

Hvað færir jafnvægið

Styrkur er helsti áhrifavaldurinn. Til að dímer myndist þurfa tveir monómerar að mætast, þannig að hlutfall dímera eykst hraðar en línulega með heildarmagni litarefnis. Birtir jafnvægisfastar fyrir dímermyndun í vatni eru á stærðarþrepinu þúsundir á mólar nálægt stofuhita, svo hlutfall dímera hækkar hratt á míkrómólarbilinu. Við víðtæka sameiginlega aðlögun líkana að gögnum yfir styrkbil frá míkrómólar upp í millímólar mældist framlag tetramera þegar við styrk undir 34 míkrómólar. Það varar við því að treysta líkani með aðeins tveimur efnaformum við tugi míkrómólar. Nákvæm hlutföll ráðast af miðlinum og þess vegna lýsir þessi grein tilhneigingum frekar en að gefa almenna umreikningstöflu.

Salt er annar áhrifavaldurinn. Uppleystar jónir skýla hleðslunum og draga úr fráhrindingu tveggja katjóna. Viðbætt natríumklóríð og sambærilegir rafvakar færa því blönduna í átt að dímerum og þyrpingum við óbreyttan litarefnisstyrk. Þessi áhrif sjást í rannsóknum á þyrpingamyndun metýlenblás í saltlausnum og vatnsmiðlum, þar sem litarefni með styrk frá um 1 míkrómólar til 3.4 millímólar var mælt við natríumklóríðstyrk frá 0 til 0.15 mólar. Í þeirri líkanaðlögun náði hlutfall tetramera um 0.93 þar sem bæði litarefnisstyrkur og saltstyrkur voru háir. Litróf mælt í vatni og litróf mælt í lífeðlisfræðilegri saltlausn eru því ekki viðmið sem hægt er að nota hvort í annars stað.

Hitastig verkar í gagnstæða átt. Stöflun losar bundið vatn en varmahreyfing vinnur gegn henni. Við hitun lausnar sundrast því yfirleitt hluti dímeranna aftur í monómera, en kæling stuðlar að tengingu þeirra. Sundrunarentalpían samkvæmt líkanaðlöguninni er neikvæð, um mínus 30 kílójúl á mól á bilinu 282 til 333 kelvin, sem staðfestir að tengingin er útvermin. Kalt sýni sem er mælt strax eftir kælingu getur virst innihalda fleiri þyrpingar en sama sýni eftir að það hefur náð jafnvægi við stofuhita.

Leysirinn ákvarðar grunnástandið. Vatn, með sín sterku vatnsfælnu áhrif, stuðlar að því að flatar litarefniskatjónir staflist. Alkóhól eins og etanól og metanól leysa hringjakerfin betur upp og rjúfa þyrpingar, svo við sama litarefnisstyrk virðist lausnin innihalda meira af monómerum í etanóli en í vatni. Óprótískir meðleysar gera það sama: í blöndum vatns og DMSO við 293 kelvin dró viðbætt DMSO úr dímermyndun. Það bendir til þess að bygging vatnsins sé drifkraftur stöflunar. Gæta þarf varúðar með yfirborðsvirk efni, því áhrifin geta verið í báðar áttir. Yfir krítískum styrk fyrir mísellumyndun geta mísellur haldið monómerum uppleystum hverjum fyrir sig og endurheimt litróf sem líkist monómerrófi. Undir þeim mörkum getur yfirborðsvirkt efni með gagnstæða hleðslu hins vegar stuðlað að stöflun: við litarefnisstyrkinn 100 míkrómólar náði fjölliðun af völdum SDS hámarki nálægt 4 millímólar SDS, um það bil helmingi styrksins sem þarf til mísellumyndunar, áður en endurdreifing varð við hærri styrk yfirborðsvirka efnisins. Rannsóknir á áhrifum leysa og skipulagðra miðla á litróf metýlenblás sýna hversu sterk áhrif nánasta sameindaumhverfi hefur á mæld bönd, ekki aðeins heildarstyrkurinn í lausninni.

pH skiptir helst máli við jaðarskilyrði. Á því nær hlutlausa bili sem notað er í flestum rannsóknum helst metýlenblátt í sínu kunnuglega bláa katjónformi og þyrpingamyndun ræður mestu um litrófið. Sterk sýra eða basi, oxunar- og afoxunarhvörf sem mynda litlausa leúkóformið, eða binding við prótein og agnir bæta hvert um sig við ástandum umfram monómer–dímer-parið. Ef litrófið breytist eftir að stuðpúða er bætt við skaltu athuga hvort hann innihaldi salt eða bindandi efnisþætti áður en allt er rakið til pH eins og sér. Viðmiðunin um efnafræði og prótónun heldur þessum spurningum um efnaform aðskildum frá spurningunni um þyrpingamyndun sem hér er fjallað um.

Hvers vegna beina línan samkvæmt Beer-Lambert bogar

Beer-Lambert-sambandið segir að gleypni sé jöfn gleypistuðli margfölduðum með styrk og ljósvegalengd. Þetta er talningarlögmál. Það gerir ráð fyrir að hlutirnir sem eru taldir haldist eins þótt þeim fjölgi eða fækki: eitt gleypandi efnaform, fast litróf, engar efnabreytingar með styrk, einlitt mæliljós, engin dreifing eða endurútgeislun og ljós sem fer í raun um uppgefna vegalengd.

Þyrpingamyndun brýtur fyrstu forsenduna. Formlega er heildargleypni áfram summa framlaga allra efnaforma: ljósvegalengd margfölduð með gleypistuðli hvers forms og styrk þess. Hvert efnaform fylgir lögmálinu. Blandan gerir það ekki, því styrkur einstakra efnaforma er ólínulegt fall af heildarmagni litarefnis. Kvörðunarferill gleypni við monómerbandið sem fall af heildarmagni litarefnis byrjar því beinn við mikla þynningu en sveigist niður þegar styrkurinn hækkar, því hver viðbót hefur hlutfallslega minna af monómerum. Ferill mældur við dímerbandið sveigist í hina áttina. Rannsóknir á þyrpingamyndun benda einmitt á þetta ferli sem orsök mældra frávika frá Lambert-Beer. Dæmigerð mistök eru að fella beina línu að bogna svæðinu og framreikna hana. Línan gildir aðeins innan þess bils og í því sýnaumhverfi sem hún var gerð fyrir.

Þynning skapar skylda gildru. Að þynna sterka stofnlausn niður á mælisvið tækisins varðveitir ekki hlutföll efnaformanna. Í þynnta sýninu í mælikerinu færist jafnvægið í átt að monómerum. Litróf þess lýsir því þynnta sýninu rétt en stofnlausninni ranglega. Að bakreikna litróf stofnlausnar með því að skala gleypnigildi upp gefur aðeins rétt mat á heildarmagni ef kvörðunin tekur þegar tillit til þessarar hliðrunar. Það endurheimtir aldrei upprunalega lögun bandanna. Sá sem ber litróf þykknis saman við þynnt viðmið er að bera saman tvær ólíkar blöndur.

Ljósvegalengd er hluti niðurstöðunnar

Gleypni er í réttu hlutfalli við vegalengdina sem ljós fer um sýnið. Mæliker með 10 mm ljósvegalengd gefur tífalda gleypni miðað við mæliker með 1 mm ljósvegalengd sem inniheldur sömu lausn. Þessi skölun er aðeins nákvæm fyrir sömu lausn og vegna þyrpingamyndunar er sá fyrirvari lykilatriði.

Í reynd er ljósvegalengd tæki til að halda mælingunni innan gilds sviðs. Löng ljósvegalengd veitir næmi fyrir þynntar lausnir sem innihalda að mestu monómera. Stutt ljósvegalengd heldur sterku sýni innan mælisviðs án mikillar þynningar sem myndi endurstilla jafnvægið. Í rannsókninni á þyrpingamyndun sem tölurnar hér að ofan byggjast á var einmitt farið þannig að: mæliker með 1 sentímetra ljósvegalengd fyrir litarefnisstyrk frá 1.1 til 34 míkrómólar og mæliker með 0.01 sentímetra ljósvegalengd fyrir styrk frá 94 míkrómólar til 3.4 millímólar. Örrúmmálsmælipallar og plötulesarar bæta við eigin rúmfræðilegum þáttum, með stuttum og stundum breytilegum ljósvegalengdum auk yfirborða þar sem katjónískt litarefni getur ásogast. Tilgreindu ljósvegalengdina með tölunni, á sama hátt og leysir og salt eru tilgreind í litrófsviðmiðuninni. Gleypni án ljósvegalengdar er ekki niðurstaða. Hún er orðrómur.

Ferlið sjálft segir til um vönduð vinnubrögð við mælingar. Láttu sýnin ná jafnvægi við sama hitastig áður en þau eru mæld. Notaðu sömu gerð mælikers og sömu stefnu þess, samsvarandi blanksýni með sama salt- og stuðpúðainnihaldi og hrein glervörur. Metýlenblátt ásogast á gler og plast og litað mæliker geymir því minningu um síðasta sterka sýnið. Mældu fljótlega eftir undirbúning þegar hraði þyrpingamyndunar skiptir máli og gerðu hvern kvörðunarferil í sama sýnaumhverfi og við sömu ljósvegalengd og óþekktu sýnin. Við sjónræna athugun skaltu muna að augað er lélegur litrófsmælir. Hvort litur lausnar geti staðfest hreinleika er sérstök spurning sem hefur neikvætt svar, og breytingar á litblæ vegna þyrpingamyndunar eru ein ástæðan.

Skýringarmynd til að hafa við tækið

Myndin hér að neðan dregur greinina saman í eitt viðmið fyrir rannsóknarbekkinn. Þrjár lausnir innihalda sama litarefni en eru ólíkar að heildarstyrk og saltinnihaldi. Einfölduð litróf þeirra sýna hvernig hlutfallslegt framlag langbylgjubands monómersins minnkar á móti stuttbylgjubandi dímersins eftir því sem stöflun eykst. Aðstæðurnar eru tilgreindar á myndinni, því án þeirra er ekki hægt að nota ferlana aftur. Fyrir mældar staðsetningar banda við tilgreindar aðstæður skaltu nota litrófsviðmiðunina. Um hvernig litarefnið kemst inn í frumur eftir að það er komið í lausn, sjá inngöngu í frumur með afoxun og skiptingu milli fasa. Um hvernig ljósorka á flatareiningu og rúmfræði hafa frekari áhrif á ljósefnafræðilegar mælingar, sjá ljósáhrif og rúmfræði mælinga.

Meginreglan sem ber að hafa í huga er tvíþætt. Litrófið sýnir hvaða blanda er til staðar í mælikerinu við tilgreindar aðstæður. Aðeins kvörðun sem gerð er við sömu aðstæður getur umbreytt gleypni í heildarstyrk.