Pewarnaan sel pipi dengan metilen biru: apa yang perlu diamati

Seorang siswa meneteskan setetes suspensi sel pipi pada kaca objek, melihat melalui mikroskop, dan hampir tidak melihat apa pun. Beberapa bentuk pucat seperti bayangan melintas di bidang terang. Ia mengatur fokus, lalu menambah cahaya, kemudian menyimpulkan bahwa kaca objek itu kosong. Kaca objek tersebut tidak kosong. Sel-selnya ada. Sel-sel itu hampir transparan, dan transparansi inilah masalah utama yang ingin diatasi oleh pewarnaan ini.

Ketidaksesuaian antara harapan dan citra ini perlu dijelaskan sebelum protokol dimulai. Pemula sering mengira mikroskop akan menampilkan detail seperti kamera yang memperbesar tulisan jauh. Mikroskop bidang terang bekerja lebih spesifik: alat ini menunjukkan perbedaan dalam penyerapan cahaya. Sel pipi yang tidak diwarnai hampir tidak menyerap cahaya, sehingga hampir tidak menghasilkan perbedaan yang terlihat. Metilen biru menambahkan perbedaan tersebut. Zat ini berikatan secara tidak merata di dalam sel dan mengubah struktur menjadi kontras. Setelah siswa memahami konsep ini, setiap langkah berikutnya akan terlihat sebagai konsekuensi logis, bukan sekadar resep.

Penjelasan dasar tentang cara pewarnaan sederhana menambah kontras di laboratorium sekolah akan membantu di sini, dan penyegaran tentang menyiapkan mikroskop bidang terang sebelum pewarnaan dapat mencegah separuh kegagalan preparat. Kimia di balik warna tersebut dibahas dalam pengantar metilen biru dalam mikroskopi, yang menjelaskan mengapa pewarna khusus ini begitu sering digunakan di meja laboratorium.

Protokol kelas

Versi preparat basah di bawah ini merupakan pilihan standar yang lebih sederhana untuk kelas umum. Metode ini tidak memerlukan nyala api maupun tahap fiksasi. Varian apusan terfiksasi yang digunakan dalam beberapa panduan perguruan tinggi menambahkan pengeringan udara dan fiksasi panas singkat, seperti dalam kegiatan apusan pipi North Central Texas College yang diterbitkan melalui Biology LibreTexts, tetapi fiksasi panas merupakan kebiasaan dalam mikrobiologi, bukan persyaratan untuk melihat sel epitel.

Yang diperlukan: kaca objek dan kaca penutup yang bersih, swab steril sekali pakai (lebih disarankan) atau tusuk gigi pipih yang baru, botol penetes berisi metilen biru berair 0.5 hingga 1 persen, air suling atau deionisasi, kertas penyerap, sarung tangan, dan mikroskop majemuk dengan perbesaran total 100x dan 400x.

1. Bilas mulut dengan air biasa. Langkah ini menghilangkan partikel makanan yang nantinya dapat terwarnai sangat kuat dan mengalihkan perhatian dari sel.
2. Setiap siswa hanya mengambil sampel dari pipinya sendiri. Gosok bagian dalam pipi dengan lembut menggunakan swab steril baru. Tekan, jangan menggores. Hentikan jauh sebelum timbul rasa tidak nyaman atau perdarahan.
3. Gulirkan swab secara tipis di bagian tengah kaca objek yang bersih. Lapisan tipis merupakan faktor terbesar yang menentukan apakah preparat mudah dibaca. Endapan putih yang tebal akan terwarnai menjadi massa biru yang sulit dibaca.
4. Tambahkan satu tetes metilen biru di atas apusan. Biarkan selama 1 hingga 3 menit. Satu menit cukup dalam banyak protokol perguruan tinggi; panduan laboratorium sains NCERT Kelas IX menggunakan sekitar 3 menit untuk preparat sementara. Lebih lama tidak berarti lebih baik, dan pewarnaan berlebihan merupakan kesalahan waktu yang paling umum.
5. Bilas perlahan dengan air suling atau serap kelebihan pewarna dengan kertas penyerap, sesuai protokol setempat. Latar belakang seharusnya menjadi biru pucat, bukan biru tua pekat.
6. Turunkan kaca penutup dengan posisi miring sehingga salah satu tepinya menyentuh terlebih dahulu, lalu biarkan turun perlahan. Cara ini membantu mencegah terbentuknya gelembung udara.
7. Mulailah dengan daya rendah untuk menemukan sel, memastikan fokus dan posisi tengah, lalu lanjutkan ke 100x dan akhirnya 400x. Pada 400x gunakan hanya pengatur fokus halus.

Konsentrasi pewarna memerlukan satu penjelasan yang presisi. Protokol sekolah umumnya menggunakan metilen biru berair sekitar 1 persen. Larutan stok yang lebih kuat atau waktu paparan yang terlalu lama menggelapkan latar belakang lebih cepat daripada menggelapkan inti, sehingga membalikkan kontras yang menjadi dasar latihan ini.

Menangani bahan dari pipi dengan aman

Sampel pipi mengandung saliva dan mikroorganisme normal di rongga mulut, jadi perlakukan setiap apusan segar sebagai bahan yang berpotensi infeksius meskipun donor adalah teman sekelas yang sehat. Pedoman biosafety American Society for Microbiology untuk laboratorium pendidikan menyatakan prinsip umumnya: nilai risiko sebelum sesi, gunakan sarung tangan, lindungi mata jika ada kemungkinan percikan, cuci tangan setelahnya, disinfeksi meja laboratorium, dan buang bahan sekali pakai yang terkontaminasi melalui jalur limbah biologis yang telah disetujui.

Empat aturan kelas mencakup sebagian besar risiko. Satu donor untuk setiap swab dan setiap kaca objek, tidak boleh digunakan bersama. Pengambilan sampel hanya dari diri sendiri, jangan pernah mengambil sampel dari teman. Swab dan tusuk gigi sekali pakai harus langsung dimasukkan ke wadah limbah yang ditentukan, bukan diletakkan kembali di meja. Metilen biru sendiri dapat menodai kulit dan pakaian serta mengiritasi mata, sehingga sarung tangan dan prosedur normal saat menangani pewarna tetap berlaku. Jangan memperluas latihan ini menjadi kultur apa pun dari apusan, dan jangan melakukan fiksasi panas secara improvisasi pada bahan manusia segar di luar prosedur keselamatan sekolah.

Apa yang perlu diamati, dan mengapa tampilannya seperti itu

Pada 100x, cari sel lebar dan pipih berwarna biru pucat dengan garis luar oval tidak beraturan atau poligonal. Sel dapat berada sendiri-sendiri atau membentuk lembaran longgar yang saling tumpang tindih. Setiap sel biasanya memiliki satu titik biru yang lebih gelap. Titik tersebut adalah inti. Perhatikan juga susunannya: sel epitel skuamosa berbentuk seperti ubin tipis, bukan bola, sehingga tepinya tampak seperti glasir retak, bukan balon bulat.

Pada 400x, tiga ciri dapat terlihat dengan jelas. Batas sel tampak sebagai garis tipis yang lebih gelap dan mengelilingi sel. Sitoplasma memenuhi bagian dalam dengan warna biru muda yang merata. Inti tampak lebih gelap dan padat, sering berbentuk oval, biasanya berada dekat bagian tengah tetapi tidak selalu. Minta siswa mencatat ketiganya beserta bentuk dan perbesarannya, karena itulah yang diminta secara khusus dalam lembar kerja.

Ada satu hal terkait ketepatan yang penting di sini dan sering keliru dalam lembar kerja. Batas yang terlihat sesuai dengan wilayah membran plasma, tetapi membran itu sendiri, yaitu lapisan ganda lipid dengan ketebalan sekitar 7 hingga 10 nanometer, jauh di bawah kemampuan resolusi mikroskop sekolah. Yang dilihat siswa adalah tepi optis sel ditambah pewarna yang terkumpul di area tersebut. Kehati-hatian yang sama berlaku untuk organel. Mitokondria, retikulum endoplasma, badan Golgi, dan ribosom tidak terlihat dalam preparat ini. Mikroskop cahaya konvensional dapat meresolusi hingga sekitar 0.2 mikrometer dalam kondisi yang baik, seperti dijelaskan dalam latar belakang biologi sel NCBI tentang alat mikroskopi, dan sebagian besar ultrastruktur berada di bawah atau dekat batas tersebut. Perbesaran kosong yang lebih tinggi hanya membuat citra lebih besar tanpa menambahkan detail.

Mengapa inti terwarnai paling gelap? Metilen biru adalah pewarna kationik, bermuatan positif dalam larutan, dan berasosiasi dengan bahan bermuatan negatif di dalam sel, terutama asam nukleat. Kromatin memusatkan DNA di dalam inti, sehingga inti mengikat pewarna paling banyak. Sitoplasma mengandung RNA dan molekul bermuatan lainnya, sehingga juga terwarnai, tetapi secara lebih menyebar dan lebih terang. Satu hal penting: metilen biru bukan pewarna yang spesifik terhadap DNA. Penelitian tentang distribusi metilen biru dalam pencitraan inti menjelaskan bahwa kation tersebut berasosiasi dengan wilayah yang kaya asam nukleat, dan penelitian kuantitatif yang lebih lama tentang pengikatan metilen biru dalam preparat sel menemukan bahwa sebagian besar pewarna yang terikat berasosiasi dengan asam nukleat. Karena itu, inti gelap dan sitoplasma terang merupakan pola kontras, bukan uji molekuler.

Kesalahan yang akan dilakukan siswa, dan cara membacanya

Hampir setiap preparat yang gagal termasuk dalam salah satu dari lima pola. Ajarkan siswa untuk mendiagnosis preparat, bukan sekadar mengulang prosesnya tanpa pertimbangan.

Pewarnaan berlebihan membuat sel dan latar belakang sama-sama gelap sehingga inti menghilang ke dalam bidang pandang. Atasi dengan waktu pewarnaan yang lebih singkat atau pembilasan yang lebih menyeluruh. Pewarnaan kurang membuat sel tampak seperti bayangan yang menghilang saat cahaya ditambah; tambahkan waktu dalam langkah tiga puluh detik. Apusan tebal menghasilkan massa padat yang saling tumpang tindih sehingga tidak ada garis luar yang dapat ditelusuri; koreksinya bersifat mekanis, yaitu sebarkan lebih tipis pada percobaan berikutnya, karena pembilasan tidak dapat memperbaiki tumpukan sel. Gelembung udara tampak sebagai lingkaran sempurna dengan tepi gelap yang tajam dan sering membingungkan pemula yang mengiranya sebagai struktur; turunkan kaca penutup secara perlahan pada sudut miring. Titik gelap kecil yang tersebar di atas atau di sekitar sel biasanya merupakan bakteri mulut normal, seperti dicatat dalam protokol sekolah seperti prosedur sel pipi Ingrid Science. Titik-titik ini menunjukkan bahwa mulut dihuni mikroorganisme, sesuatu yang mungkin mudah diingat siswa, tetapi bakteri tersebut tidak dapat diidentifikasi hingga tingkat spesies dalam latihan ini dan tidak boleh digambar sebagai bagian sel. Sisa makanan dan untaian lendir terwarnai secara tidak beraturan dan kuat; pembilasan awal dilakukan untuk menguranginya.

Hal yang tidak dapat dilakukan oleh latihan ini

Ini adalah pengamatan edukatif, bukan tes diagnostik. Tidak ada aspek dari tampilan sel dalam pewarnaan kelas yang dapat digunakan untuk mendiagnosis infeksi, kanker, atau penyakit apa pun, dan artikel ini tidak boleh dibaca seolah-olah menyatakan hal tersebut. Preparat ini menunjukkan bentuk, batas, sitoplasma, dan inti pada dua perbesaran. Preparat ini tidak menunjukkan ultrastruktur membran, detail organel, atau identitas molekuler. Menyatakan batasan ini secara eksplisit melindungi ketepatan ilmiah sekaligus siswa: hasil yang baik adalah gambar berlabel dengan perbesaran dan pewarna yang dicatat dengan benar, bukan kesimpulan tentang kesehatan.

Lembar kerja siswa dan mikrograf berlabel

Dua aset proyek untuk halaman ini adalah mikrograf berlabel di atas dan lembar kerja di bawah. Cetak satu lembar kerja untuk setiap siswa atau proyeksikan lembar tersebut dan minta siswa menyalin kotak-kotaknya ke buku catatan.

Cara menggunakannya dalam sesi 45 menit: sepuluh menit untuk penjelasan keselamatan dan pengambilan sampel, sepuluh menit untuk pewarnaan dan pemasangan preparat, lima belas menit untuk pengamatan dan pembuatan sketsa pada kedua perbesaran, sepuluh menit untuk daftar periksa dan perbandingan dengan mikrograf berlabel. Butir daftar periksa sengaja dibuat mekanis. Apusan tipis, waktu pewarnaan yang tepat, inti lebih gelap daripada sitoplasma, perbesaran dicatat. Siswa yang dapat mencentang keempatnya telah memahami konsep yang menjadi tujuan pelajaran ini: mikroskop menampilkan perbedaan, dan pewarna menciptakan perbedaan yang layak ditampilkan. :::