Pewarna biru metilena alkali Loeffler dan polikrom dijelaskan

Tiga botol dapat berada berdampingan di meja pewarnaan, masing-masing berlabel salah satu varian biru metilena. Satu bertuliskan biru metilena akuatik 1%. Satu bertuliskan biru metilena alkali Loeffler. Satu lagi bertuliskan biru metilena polikrom. Seorang pekerja yang sibuk mengambil botol mana pun yang paling dekat. Apusan kemudian terwarnai terlalu pucat, atau terlalu seragam biru, atau dalam nuansa ungu yang tidak terduga, lalu hasilnya disalahkan pada sampel.

Ini adalah masalah formulasi, bukan masalah sampel. Ketiga larutan tersebut mengandung zat warna yang berkerabat tetapi mewakili konsep pewarnaan yang berbeda. Yang pertama adalah zat warna kationik biasa pada pH mendekati netral. Yang kedua adalah zat warna yang sama yang dibuat lebih agresif dengan alkali. Yang ketiga bukan lagi satu zat warna tunggal, melainkan campuran yang sengaja dioksidasi. Gunakan yang salah dan prinsip pewarnaannya berubah saat digunakan.

Jawaban singkat

Biru metilena akuatik biasa adalah acuan dasar: sekitar 1% zat warna dalam air, pewarna kationik sederhana untuk morfologi bakteri dan mikroskopi umum. Biru metilena alkali Loeffler menambahkan sejumlah kecil alkali encer yang terukur ke stok beralkohol yang diencerkan dalam air, sehingga menaikkan pH dan mendorong zat warna kationik berikatan lebih kuat dengan struktur bakteri yang bersifat asam. Biru metilena polikrom adalah biru metilena yang sengaja dimatangkan melalui oksidasi dalam alkali, sehingga botol tersebut berisi campuran homolog yang mengalami demetilasi (azure A, azure B, azure C), thionin, dan violet metilena bersama sisa biru metilena, dan campuran tersebut mewarnai struktur yang berbeda dengan rona yang berbeda.

Jika Anda hanya mengingat satu kalimat: alkalinisasi mengubah intensitas pewarnaan, sedangkan polikromisasi mengubah warna pewarnaan.

Biru metilena akuatik biasa: titik acuan

Formulasi paling sederhana adalah biru metilena yang dilarutkan dalam air, umumnya pada 1% w/v, tanpa alkali dan tanpa oksidasi. Spesies berwarnanya adalah kation methylthioninium dengan ion lawan klorida, zat warna phenothiazine kecil dan datar yang dijelaskan dalam catatan biru metilena PubChem sebagai methylthioninium chloride. Sebagai kation, zat ini berikatan dengan tulang punggung fosfat pada asam nukleat dan gugus asam pada dinding sel bakteri, sehingga mewarnai sel menjadi biru dengan latar belakang terang.

Keunggulannya adalah keterprediksiannya. Nukleus dan bakteri tampak biru. Kontrasnya sedang. Organisme yang samar dapat terwarnai lemah, dan keterbatasan inilah yang hendak diatasi oleh Loeffler. Untuk keluarga pewarna bakteri sederhana yang lebih luas yang mencakup larutan ini, lihat ikhtisar pewarnaan sederhana bakteri. Disiplin identifikasi tetap penting di sini: methyl blue adalah molekul yang sama sekali berbeda, sebagaimana dijelaskan dalam methyl blue versus methylene blue, sehingga pencarian katalog berdasarkan nama warna saja dapat menghasilkan kelas zat warna yang salah.

Biru metilena alkali Loeffler: zat warna yang sama, didorong lebih kuat

Resep klasik Loeffler menggabungkan stok biru metilena beralkohol dengan alkali encer dalam air. Versi buku teks menggunakan 0.3 g zat warna dalam 30 mL etanol 95% ditambah 100 mL kalium hidroksida akuatik 0.01% (atau setara dengan 30 mL biru metilena beralkohol jenuh, 100 mL air suling, dan 1 mL KOH 1%), menghasilkan larutan kerja dengan sekitar 0.3% zat warna pada pH yang jelas alkali. Versi komersial mengikuti prinsip yang sama, dan katalog pewarna mikrobiologi Thermo Fisher mencantumkan biru metilena alkali Loeffler bersama varian polikrom dan akuatik sebagai item katalog terpisah dengan penggunaan yang dimaksudkan masing-masing.

Alkali adalah inti mekanismenya. Peningkatan pH mendeprotonasi gugus karboksil dan fosfat pada spesimen, sehingga meningkatkan kepadatan situs bermuatan negatif, sedangkan stok etanol menjaga zat warna tetap larut sepenuhnya sehingga mencapai situs tersebut dalam bentuk monomer. Hasilnya adalah pewarnaan bakteri yang lebih cepat dan lebih intens dibandingkan zat warna akuatik netral, dengan bentuk batang dan kokus biru tua yang lazim pada apusan bakteriologis rutin. Waktu pewarnaan biasanya satu hingga tiga menit, kemudian diikuti pembilasan dengan air.

Aplikasi klasiknya adalah Corynebacterium diphtheriae yang ditumbuhkan pada medium serum Loeffler: batang ramping, sering berbentuk gada, dengan granula metakromatik Babes-Ernst yang terwarnai kuat dan menyimpan polifosfat. Pasangan medium dan pewarna ini bersifat historis, keduanya dikaitkan dengan ahli bakteriologi yang sama, dan kontras granula merupakan hasil diagnostik yang diharapkan. Di luar pekerjaan terkait difteri, pewarna ini digunakan sebagai pewarna bakteriologis umum untuk apusan dari kultur, untuk morfologi Neisseria pada apusan klinis, dan di mana pun pewarnaan Gram tidak diperlukan tetapi biru akuatik biasa terlalu pucat. Ini adalah pewarna monokrom. Semua yang bersifat asam akan memperoleh suatu nuansa biru. Ketika sebuah protokol memerlukan perbedaan warna, alkali saja tidak dapat menyediakannya.

Satu peringatan praktis: larutan zat warna alkali memburuk dan mengendap selama penyimpanan dan penyerapan karbon dioksida. Laboratorium biasanya menyiapkan volume secukupnya atau membeli larutan katalog dan mematuhi masa simpannya, alih-alih terus menggunakan botol lama yang kini meninggalkan endapan pada setiap kaca objek.

Biru metilena polikrom: satu nama, beberapa zat warna

Biru metilena polikrom berawal dari zat warna yang sama tetapi menjalani oksidasi terkendali dalam alkali, yang secara historis disebut pematangan atau polikromisasi. Penuaan dalam kondisi alkali, pemanasan dengan karbonat, atau oksidasi dengan agen seperti dikromat secara bertahap melepaskan gugus metil dari substituen dimetilamino. Produknya adalah campuran: sisa biru metilena ditambah azure B (kehilangan satu gugus metil), azure A dan azure C (demetilasi lebih lanjut), thionin (terdemetilasi sepenuhnya), serta produk samping oksidatif dari keluarga violet metilena. Setiap komponen memiliki rona dan afinitas jaringan masing-masing, sehingga campuran tersebut mewarnai secara metakromatik: nukleus, granula, musin, dan kartilago masing-masing memperoleh rona berbeda dari biru hingga merah-ungu.

Kimia ini sama dengan kimia di balik pewarna darah yang terkenal. Para peneliti awal menemukan bahwa biru metilena yang dibuat alkali mewarnai nukleus parasit malaria dalam nuansa ungu, tetapi larutan akuatik yang dimatangkan tersebut tidak stabil dan mengendap dalam beberapa hari. Tinjauan tentang bagaimana pewarna darah ungu ditemukan menelusuri bagaimana Malachowski dan Romanowsky secara independen memanfaatkan efek ini pada 1891, bagaimana metanol diperkenalkan untuk menstabilkan endapan zat warna dan memfiksasi film tanpa panas, serta bagaimana Giemsa kemudian menstandardisasi campuran berdasarkan azure B terukur ditambah eosin dengan stabilisasi gliserol. Pewarna tipe Giemsa modern merupakan turunan langsung dari biru metilena polikrom plus eosin, kombinasi yang menghasilkan efek Romanowsky. Untuk pasangan eosin dan komponen azure B secara terperinci, lihat pewarna tipe Romanowsky dan interaksi azure B eosin.

Karena berupa campuran, biru metilena polikrom secara alami merupakan yang paling tidak terstandardisasi di antara ketiganya. Keseimbangan rona yang tepat bergantung pada jalur dan tingkat oksidasi, sehingga pemasok histologi menjualnya sebagai produk tersendiri dengan pengujian kinerja sendiri, bukan sebagai Loeffler yang dibiarkan menua. Penggunaan yang umum mencakup demonstrasi metakromatik granula sel mast, musin, dan kartilago, detail sel plasma, serta Helicobacter pylori pada potongan jaringan dengan metode polikrom tipe Goodpasture. Ini merupakan pilihan yang tepat ketika tujuannya adalah diferensiasi berdasarkan warna, dan pilihan yang salah ketika protokol mengharapkan siluet bakteri monokrom yang bersih.

Perbandingan formulasi dan tujuan

Baca tabel tersebut sebagai prosedur pengambilan keputusan. Jika spesimen terwarnai terlalu pucat, ubah konsep pH dan gunakan Loeffler. Jika semuanya terwarnai tetapi tidak ada yang dapat dibedakan, ubah konsep zat warna dan gunakan polikrom. Jika apusan Loeffler menampilkan granula dengan jelas tetapi supervisor bertanya mengapa nukleus dan sitoplasma memiliki warna biru yang sama, jawabannya adalah bahwa tidak ada pewarna monokrom alkali yang dapat melakukan tugas tersebut. Pertanyaan itu termasuk dalam keluarga polikrom dan turunan pewarna darahnya.

Menghindari kekeliruan yang umum

Dua kesalahan menyebabkan sebagian besar kebingungan. Yang pertama adalah menganggap Loeffler dapat saling menggantikan dengan biru metilena biasa karena keduanya tampak biru di dalam botol. Keduanya berbeda dalam pH dan intensitas, dan mengganti Loeffler yang ditentukan protokol dengan zat warna netral justru menghilangkan kontras granula yang menjadi alasan protokol tersebut dibuat. Yang kedua adalah menganggap setiap biru alkali yang sudah lama atau tidak sengaja menua sebagai polikrom. Penuaan yang tidak terkendali menghasilkan campuran yang tidak diketahui pada kekuatan yang tidak diketahui, sedangkan larutan polikrom yang sebenarnya disiapkan melalui jalur oksidasi yang ditentukan dan, dalam garis keturunan pewarna darah, dikombinasikan dengan eosin terukur. Sejarah memberikan pelajaran di sini: larutan akuatik matang yang tidak stabil pada 1890-an digantikan oleh formulasi metanol yang distabilkan tepat karena campuran yang tidak terkendali tidak dapat direproduksi, sebuah pelajaran yang layak diingat sebelum mewarnai kaca objek diagnostik menggunakan botol dengan usia yang tidak pasti.

Disiplin penamaan melengkapi proses ini. Konfirmasikan item katalog (akuatik vs Loeffler vs polikrom), kandungan zat warna, dan penggunaan yang dimaksudkan pada label alih-alih menyimpulkannya dari warna. Ketiga formulasi tersebut memiliki nenek moyang kromofor yang sama. Ketiganya tidak memiliki tujuan yang sama. :::