Artikel
Methylene blue sebagai indikator anaerobik dan oksigen: apa yang dibuktikan oleh perubahan warna
Seorang teknisi menutup rapat jar anaerobik, memeriksa strip indikator methylene blue melalui tutupnya, dan melihat apa yang ingin ia lihat. Strip telah berubah dari biru menjadi putih. Ia mencatat proses tersebut sebagai anaerobik lalu melanjutkan pekerjaan. Dua hari kemudian, satu plate tidak menunjukkan pertumbuhan apa pun, sementara sebuah tabung broth tertutup di dalam jar yang sama menunjukkan tanda paparan oksigen. Strip itu menyampaikan keadaan yang sebenarnya. Pertanyaan yang diajukan kepadanya keliru.
Kebingungan ini adalah kekeliruan konsep. Indikator anaerobik methylene blue merupakan konsep redoks, bukan konsep sterilitas dan bukan konsep validasi seluruh sistem. Setelah perbedaan tersebut dipahami, strip menjadi instrumen yang presisi dan jujur dengan fungsi yang sempit.
Konsepnya: pasangan redoks reversibel
Methylene blue terlarut berada dalam dua keadaan. Bentuk teroksidasinya adalah kation biru yang dikenal luas. Bentuk tereduksinya, yang disebut leucomethylene blue, tidak berwarna. Di sekitar pH netral, reaksi setengah yang disederhanakan adalah satu kation biru ditambah satu proton dan dua elektron menghasilkan satu molekul leuco yang tidak berwarna. Potensial formalnya berada di sekitar plus 11 millivolts terhadap elektroda hidrogen standar pada pH 7, sehingga berada dalam rentang yang dapat dicapai oleh banyak sistem pereduksi dan dapat dibalik oleh oksigen.
Reduksi membutuhkan potensial redoks lokal yang rendah. Menghilangkan oksigen saja tidak selalu cukup. Penelitian awal mengenai anaerobiosis menemukan bahwa methylene blue dalam air biasa yang bebas oksigen tetap mempertahankan warnanya kecuali terdapat zat pereduksi, dan bahwa campuran broth dextrose dengan sekitar 0.01 percent zat warna mudah kehilangan warna pada 37 C, sementara campuran yang sama pada 4 C tetap biru selama satu hari, sebagaimana dilaporkan dalam eksperimen pada jaringan segar dan kondisi kultur anaerobik. Suhu, pH, glukosa, askorbat, thioglycollate, dan aktivitas pereduksi mikroba semuanya menentukan apakah elektron tersedia.
Reoksidasi hanya membutuhkan oksigen. Ketika udara mencapai bentuk leuco, bentuk tersebut berubah kembali menjadi biru. Indikator rekayasa modern memanfaatkan tepat siklus ini: zat warna ditambah reduktan dan matriks penstabil, tidak berwarna pada kadar oksigen rendah dan kembali biru saat terpapar udara, seperti ditunjukkan dalam indikator oksigen hibrida methylene blue berbasis zat warna, reduktan, surfaktan, dan lempung. Prototipe tersebut menggunakan 0.01 millimolar zat warna dengan 2.0 millimolar askorbat atau glukosa pada pH 11, menjadi tidak berwarna di sekitar 0.5 volume percent oksigen, dan membedakan kadar di bawah 0.1 percent dari di atas 0.5 percent oksigen dalam ruang pengujiannya.
Jadi, prinsip operasionalnya sederhana. Biru berarti zona indikator berada dalam keadaan teroksidasi. Tidak berwarna berarti zona indikator telah mencapai kondisi pereduksi dengan oksigen rendah. Perubahannya reversibel, lokal, dan bersifat kimia. Perubahan itu sendiri tidak mengatakan apa pun tentang mikroba.
Cara kerja strip indikator methylene blue dalam jar anaerobik
Strip indikator methylene blue untuk jar anaerobik adalah zona reaksi kecil yang ditempatkan di atmosfer jar agar dapat dilihat tanpa membuka wadah. Format komersial berbeda-beda: strip kertas, tablet yang dilarutkan atau dibasahi saat penyiapan, dan kertas hibrida yang lebih baru. Sebagian memerlukan satu tetes air suling untuk mengaktifkan zona reaksi. Sebagian lainnya berupa perangkat format kering yang harus tetap kering. Lembar petunjuk untuk produk tertentu harus dijadikan acuan, karena hidrasi, penempatan, dan waktu pembacaan merupakan bagian dari proses kimianya.
Dalam praktiknya, pembacaan yang dimaksud bersifat biner. Biru berarti oksigen atau kondisi yang belum cukup mereduksi masih terdapat pada strip. Putih atau tidak berwarna berarti kondisi redoks anaerobik telah terbentuk pada strip. Beberapa kertas komersial menambahkan pigmen latar merah, sehingga titik akhir dalam keadaan tereduksi tampak merah muda, bukan putih. Ketahui titik akhir yang dijanjikan produk Anda sebelum menilainya.
Waktu berbeda-beda menurut sistem. Dalam salah satu konfigurasi bergaya GasPak, pemudaran mulai terjadi dalam waktu sekitar satu jam dan selesai dalam beberapa jam, sementara perbandingan terkontrol pada suhu ruang membutuhkan lebih dari enam jam untuk methylene blue. Potensial redoks media dalam penelitian tersebut mencapai sekitar minus 100 millivolts dalam 60 hingga 100 menit, jauh sebelum zat warna selesai berubah, dan berada jauh di bawah minus 200 millivolts ketika strip menjadi sepenuhnya tidak berwarna. Indikator tertinggal dibandingkan perubahan atmosfer. Strip biru pada jam pertama tidak membuktikan kegagalan, dan strip putih pada jam keenam menggambarkan kondisi strip pada jam keenam.
Penempatan penting karena alasan yang sama. Pertahankan strip di headspace, terlihat melalui tutup, serta jauh dari permukaan agar dan media kultur. Strip melaporkan lingkungan langsung di sekitarnya. Jika ditempatkan rata menempel pada dinding dingin, tertimbun di bawah plate, atau terendam kondensat, strip akan melaporkan kondisi mikro tersebut, bukan kondisi jar secara keseluruhan.
Apa yang diungkapkan strip dan apa yang tidak
Anggap indikator methylene blue pada jar anaerobik sebagai satu sensor di satu lokasi. Indikator tersebut menetapkan kondisi redoks dan oksigen lokal pada zona reaksinya sendiri, yang secara umum dapat mewakili headspace jika pencampuran dan ekuilibrasi memadai. Segala kesimpulan di luar itu merupakan inferensi, dan inferensi memerlukan bukti tersendiri.
Strip yang tidak berwarna tidak menetapkan sterilitas. Sterilitas adalah ketiadaan organisme yang masih hidup, yang dibuktikan melalui sterilisasi tervalidasi dan kontrol validasi kultur. Sebuah jar dapat sepenuhnya anaerobik tetapi tetap terkontaminasi, atau sepenuhnya steril tetapi tetap aerobik.
Strip juga tidak memvalidasi setiap bagian dari sistem kultur. Oksigen terlarut di dalam tabung tertutup, oksigen yang terperangkap dalam agar bagian dalam, gradien dalam jar yang padat, serta kebocoran yang muncul setelah pembacaan tidak dapat terdeteksi oleh satu strip. Eksperimen spasial menunjukkan zona biru dan tidak berwarna yang bersebelahan dalam wadah yang sama ketika penetrasi oksigen dan aktivitas pereduksi mencapai keseimbangan secara berbeda. Satu titik tidak dapat mensertifikasi suatu volume.
Strip tidak membuktikan anaerobiosis yang berlangsung tanpa terputus. Strip yang dibaca sekali saat penyiapan tidak mengatakan apa pun mengenai jam kedua puluh. Penelitian mutu anaerobik terbaru memperingatkan bahwa indikator kimia menggambarkan atmosfer pada saat indikator dibaca dan dapat tampak memadai meskipun masih terdapat sedikit oksigen residual. Dokumentasi berkelanjutan atau pada checkpoint, bukan satu kali melihat titik akhir, adalah yang menghubungkan hasil strip dengan masa inkubasi.
Untuk penjelasan kimia yang mendasari perubahan warna tersebut, lihat cara methylene blue bersiklus antara keadaan teroksidasi dan tereduksi. Untuk memahami bagaimana oksigen memengaruhi penanganan sampel secara lebih luas, lihat pengendalian oksigen dalam pekerjaan mikroskopi dan kultur.
Diagram untuk ditempatkan di samping jar
Gambar di bawah merangkum artikel ini menjadi satu referensi meja kerja. Tiga keadaan dari strip yang sama, dua arah reaksi, dan batas antara bukti dari indikator dengan validasi sistem.
| Pengamatan | Pembacaan yang sah | Langkah berikutnya yang diperlukan |
|---|---|---|
| Strip tetap biru setelah waktu yang ditentukan produk | Anaerobiosis belum terverifikasi pada strip | Periksa seal, aktivasi dan kapasitas sachet, catalyst jika berlaku, hidrasi dan masa berlaku strip; jangan interpretasikan kultur terlebih dahulu |
| Strip memudar selama beberapa jam lalu tetap tidak berwarna | Kondisi pereduksi telah terbentuk pada strip pada waktu tersebut | Catat waktu dan warna; pertahankan checkpoint selama inkubasi |
| Strip tidak berwarna sebelum dibuka, biru setelah dibuka | Reoksidasi yang diharapkan akibat paparan udara | Gunakan pembacaan sebelum pembukaan sebagai titik akhir; jangan secara retrospektif menyatakan proses gagal |
| Strip tidak berwarna tetapi sebuah tabung tampak teroksidasi | Hanya pembacaan lokal | Perlakukan tabung berdasarkan buktinya sendiri; periksa gradien, oksigen terlarut, dan pemuatan |
| Warna strip apa pun dengan pertumbuhan atau tanpa pertumbuhan | Tidak ada kesimpulan mengenai sterilitas atau viabilitas | Gunakan kontrol sterilitas dan viabilitas terpisah |
Mode kegagalan yang membuat strip tetap biru, atau memberi keyakinan palsu
Sebagian besar kegagalan termasuk dalam lima kelompok. Masing-masing memiliki ciri yang berbeda.
Jar atau pouch yang bocor terus memasukkan oksigen ke zona reaksi. Strip tetap biru atau kembali membiru setelah sempat memudar. Periksa tutup, gasket, clamp, dan permukaan penyegelan sebelum menyalahkan proses kimianya.
Generator gas yang sudah habis atau salah diaktifkan tidak pernah menghilangkan oksigen. Pada sistem lama yang diaktifkan dengan air, tidak munculnya kondensasi sekitar 10 hingga 15 menit dan tidak adanya pemanasan tutup sekitar 20 hingga 40 menit merupakan tanda peringatan awal untuk sistem tersebut. Sachet berkapasitas terlalu kecil dalam jar yang terlalu penuh gagal dengan cara yang sama.
Catalyst yang teracuni hanya relevan untuk sistem lama berbasis hidrogen plus palladium, ketika palladium menggabungkan hidrogen dan oksigen menjadi air. Kelembapan dan hidrogen sulfida menurunkan kinerjanya. Banyak sachet modern tidak menggunakan palladium sama sekali, jadi jangan menerapkan perbaikan ini jika tidak relevan.
Strip yang terdegradasi atau salah ditangani dapat gagal tanpa tanda yang jelas. Zat warna dan reduktan kehilangan reversibilitas selama penyimpanan, yang merupakan salah satu alasan formulasi hibrida dikembangkan agar tahan terhadap photofading dan penurunan kualitas selama penyimpanan. Tolak stok kedaluwarsa, stok dengan warna awal yang tidak normal, serta strip yang dibasahi ketika seharusnya kering atau dibiarkan kering ketika seharusnya dibasahi.
Gradien atau keterlambatan dapat menyesatkan pembaca meskipun proses kimianya bekerja dengan benar. Headspace yang tidak tercampur dengan baik, tabung tertutup yang mengandung oksigen terlarut, dan media semipadat masing-masing mempertahankan kondisinya sendiri lebih lama daripada yang ditunjukkan strip. Strip resazurin berubah melalui warna merah muda sebelum menjadi tidak berwarna dan sering dipasarkan sebagai lebih cepat, tetapi ambang batasnya bergantung pada formulasi masing-masing dan tidak dapat diterapkan pada methylene blue.
Kontrol dan protokol pembacaan yang layak disalin
Dua kontrol murah dapat menangkap sebagian besar kesalahan pembacaan. Simpan strip kontrol udara baru di udara ruangan bersama proses yang sedang berjalan. Strip methylene blue yang bekerja dengan benar tetap biru di sana. Beberapa indikator kemasan mulai dengan warna pucat lalu menjadi biru setelah dibuka, yang dengan sendirinya merupakan pemeriksaan fungsi. Selain itu, secara berkala tempatkan strip baru dalam konfigurasi anaerobik yang sebelumnya telah divalidasi. Strip harus mencapai titik akhir tereduksi yang telah divalidasi dalam waktu yang ditentukan produk. Jika salah satu kontrol menunjukkan perilaku tidak semestinya, ganti lot sebelum mempercayai pembacaan jar.
Protokol pembacaan mengikuti mekanismenya. Tempatkan strip di lokasi yang memungkinkan headspace terlihat tanpa membuka jar, sesuai lembar produk mengenai kontak dengan dinding dan pembasahan. Catat warna awal, waktu jar ditutup rapat, dan warna pada checkpoint yang ditentukan produk. Jika wadah memungkinkan, catat bahwa indikator tetap dalam keadaan tereduksi pada checkpoint yang telah ditentukan selama inkubasi. Catat warna akhir tepat sebelum pembukaan. Warna sebelum pembukaan tersebut adalah titik akhir untuk proses itu. Setelah dibuka, perubahan kembali menjadi biru adalah hal yang diharapkan dan tidak boleh digunakan untuk mengubah interpretasi kondisi sebelumnya.
Jika strip tetap biru melewati waktu yang ditentukan, anggap anaerobiosis belum terverifikasi. Periksa rangkaian penyebab secara berurutan: seal, sachet, catalyst jika ada, hidrasi dan masa berlaku indikator, kemudian fungsi indikator dibandingkan dengan kontrol udara. Hanya setelah atmosfer terverifikasi, pertumbuhan atau tidak adanya pertumbuhan dapat diinterpretasikan menggunakan penyiapan kultur anaerobik dan kontrol organisme yang sesuai dengan aplikasinya.
Strip memiliki kewenangan terakhir hanya dalam domainnya sendiri. Biru atau tidak berwarna, strip menjawab satu pertanyaan mengenai satu tempat pada satu waktu. Ajukan pertanyaan tersebut sesuai jadwal, dengan kontrol di sampingnya, dan strip akan memberikan jawaban yang dapat diandalkan. Tanyakan tentang sterilitas, tentang setiap tabung, atau tentang seluruh masa inkubasi hanya dari satu kali pengamatan, dan tidak ada kimia indikator yang dapat membuat pembacaan itu menjadi sah. :::