Mengukur efek mitokondria metilen biru: oksigen, ATP, dan potensial membran

Misalkan sebuah laboratorium menambahkan metilen biru ke mitokondria dengan respirasi terganggu dan mengamati konsumsi oksigen meningkat. Kalimat yang secara alami muncul adalah bahwa zat warna tersebut memulihkan fungsi mitokondria. Kalimat itu mungkin salah. Fluks oksigen, sintesis ATP, dan potensial membran adalah tiga konsep yang berbeda. Ketiganya menggunakan organel yang sama sebagaimana pencadangan, sinkronisasi, dan berbagi menggunakan folder cloud yang sama: saling terkait, tetapi diatur oleh aturan yang berbeda. Jika salah satunya disamakan dengan yang lain, interpretasinya akan gagal, bahkan ketika setiap pengukuran secara teknis benar.

Metilen biru membuat kebingungan ini lebih mungkin terjadi karena zat tersebut ikut berpartisipasi dalam sistem yang diukurnya. Ia merupakan pengayun redoks yang menerima elektron di bagian hulu dan menyumbangkannya di bagian hilir, kation lipofilik yang terakumulasi dalam mitokondria yang terenergikan, serta senyawa berwarna biru pekat yang menyerap dan memancarkan cahaya pada pita yang sama dengan probe umum. Satu pembacaan saja tidak dapat menanggung semua beban interpretasi itu. Pola yang andal, sebagaimana ditunjukkan dalam berbagai studi mitokondria Budapest, adalah mengukur fluks oksigen ditambah laju sintesis ATP ditambah potensial membran ditambah pelepasan hidrogen peroksida, dengan kontrol khusus zat warna pada setiap tahap.

Respirometri mengukur fluks oksigen, bukan keluaran energi

Respirometri resolusi tinggi, baik menggunakan Oroboros Oxygraph maupun Seahorse extracellular flux analyzer, melaporkan satu hal: seberapa cepat oksigen direduksi. Respirometri tidak melaporkan berapa banyak proton yang dipompa per elektron, seberapa besar gradien yang dipertahankan, atau apakah ATP sintase menggunakannya.

Istilah yang digunakan penting. Pada mitokondria terisolasi, substrat tanpa ADP menghasilkan respirasi kebocoran, substrat dengan ADP jenuh menghasilkan kapasitas fosforilasi oksidatif, dan titrasi uncoupler menghasilkan kapasitas transfer elektron maksimum. Pada sel utuh, padanan Seahorse-nya adalah respirasi basal, respirasi terkait ATP yang sensitif terhadap oligomisin, kebocoran proton, respirasi maksimal yang ditentukan FCCP, serta konsumsi oksigen nonmitokondria yang resisten terhadap rotenon ditambah antimycin. Menyebut keluaran Seahorse sebagai State 3 dan State 4 memberikan kesan presisi yang tidak didukung oleh preparasinya, sebagaimana dijelaskan dalam kerangka Agilent Mito Stress Test.

Metilen biru memutus hubungan intuitif antara lebih banyak oksigen dan lebih banyak energi. Pada mitokondria otak marmot terisolasi, zat warna 100 nM hingga 1 uM meningkatkan konsumsi oksigen istirahat dengan substrat glutamat ditambah malat, suksinat, dan alpha-glycerophosphate, dengan kenaikan sekitar 64 percent pada alpha-glycerophosphate, sementara respirasi yang distimulasi ADP pada mitokondria sehat pada dasarnya tidak berubah, menurut studi mitokondria otak terisolasi. Karena kebocoran meningkat sementara fluks yang distimulasi ADP tetap datar, rasio kontrol respirasi yang dihitung menurun. Penurunan tersebut tidak berarti zat warna merusak mitokondria. Artinya, zat warna menambahkan siklus redoks yang mengonsumsi oksigen di atas respirasi normal. Uji konsumsi oksigen metilen biru yang hanya melaporkan kenaikan tersebut telah mengukur kimia yang nyata tetapi belum mengatakan apa pun tentang konservasi energi.

Eksperimen pemulihan menunjukkan kesenjangan yang sama pada skala lebih besar. Ketika Complex I diblokir, fluks oksigen pulih sekitar tiga kali lipat sementara sintesis ATP hanya pulih sekitar 1.5 kali lipat. Lebih banyak oksigen mencapai elektroda. Lebih sedikit di antaranya digunakan untuk menghasilkan ATP. Setiap klaim mengenai peningkatan fosforilasi oksidatif memerlukan sisi ATP dalam perhitungannya, idealnya dinyatakan sebagai rasio ATP per oksigen dengan konvensi penyebut yang disebutkan.

Uji ATP mengukur laju sintesis, yang tidak dapat digantikan oleh kandungan

Uji ATP menjawab pertanyaan yang berbeda: berapa banyak ATP yang dihasilkan per satuan waktu. Pembacaan kinetik, baik luminesensi firefly luciferase yang dilacak selama beberapa menit maupun uji berpasangan hexokinase ditambah glucose-6-phosphate dehydrogenase yang dibaca pada 340 nm, menghasilkan suatu laju. Pengukuran total ATP pada satu titik akhir menghasilkan kandungan, yang mencerminkan sintesis dikurangi konsumsi dan, jika digunakan sendiri, hanya memberikan sedikit informasi tentang fosforilasi oksidatif.

Kelompok Budapest menggunakan metode enzimatik berpasangan dengan adenylate kinase ditekan, dan menemukan bahwa metilen biru pada 1 hingga 2 uM secara moderat tetapi signifikan meningkatkan produksi ATP pada mitokondria yang diberi rotenon dan antimycin. Itu merupakan pemulihan yang nyata, dan sifatnya parsial. Studi toksisitas TEGDMA menghasilkan pola jawaban yang sama dalam model berbeda: monomer dental TEGDMA 5 mM menurunkan respirasi terkait Complex I dari sekitar 286 menjadi 28 unit fluks, dan zat warna 2 uM memulihkannya hingga sekitar 86.

Dua kontrol tidak dapat ditawar ketika bekerja dengan senyawa redoks berwarna. Pertama, gunakan oligomisin untuk menetapkan seberapa besar sintesis ATP yang diukur bergantung pada ATP sintase. Kedua, lakukan pemulihan spike tanpa sel menggunakan ATP yang jumlahnya diketahui ditambah reagen lengkap ditambah konsentrasi zat warna persis seperti yang digunakan, setidaknya 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, dan 2 uM. Zat warna dapat menyerap cahaya yang dipancarkan, menghambat enzim reporter, atau mengubah kimia redoks reagen, dan panduan umum uji luciferase merekomendasikan skrining balik biokimia untuk jenis interferensi ini. Jangan menganggap 1 uM bebas artefak hanya karena quenching biasanya lebih buruk pada konsentrasi yang lebih tinggi.

Probe potensial membran mengukur distribusi zat warna, bukan fluks

Safranine O, TMRM dan TMRE, rhodamine 123, serta JC-1 semuanya merupakan kation yang dapat menembus membran. Senyawa-senyawa tersebut terakumulasi dalam matriks bermuatan negatif sesuai keseimbangan elektrokimia, sehingga fluoresensi bulk melaporkan potensial secara tidak langsung melalui lokasi probe. Tidak satu pun mengukur ATP atau fluks elektron.

Setiap probe memiliki preparasi yang paling sesuai. Safranine O sesuai untuk mitokondria terisolasi dan sel yang dipermabilisasi, biasanya mendekati 2 uM dengan eksitasi dekat 495 nm dan emisi dekat 585 nm, serta bekerja dalam rezim quenching di mana pengambilan probe mengubah fluoresensi bulk. TMRM dan TMRE sesuai untuk sel utuh dengan pemuatan nanomolar rendah dalam mode non-quenching, di mana depolarisasi melepaskan zat warna dan fluoresensi mitokondria menurun; pada pemuatan tinggi, arah sinyal dapat berbalik akibat self-quenching. JC-1 memberikan rasio hijau terhadap merah yang praktis tetapi bergantung pada pemuatan dan massa mitokondria, sehingga kurang kuat untuk pekerjaan kuantitatif dibandingkan TMRM yang dikontrol dengan cermat. Pertukaran keuntungan dan keterbatasan ini dirangkum dalam ulasan yang banyak digunakan mengenai probe potensial membran mitokondria.

Metilen biru mengganggu secara optik tepat pada konsentrasi kerja tersebut. Pita absorpsinya dekat 600 hingga 665 nm tumpang tindih dengan emisi probe merah, sehingga efek inner-filter, quenching, dan absorpsi cahaya eksitasi semuanya masuk akal. Zat warna ini juga merupakan kation lipofilik kedua yang distribusinya sendiri berubah mengikuti potensial yang sedang diukur. Pertahanannya adalah redundansi ditambah blanko: probe saja, zat warna saja, probe ditambah setiap konsentrasi zat warna, depolarisasi penuh dengan FCCP sebagai referensi nol, dan idealnya probe kedua yang berbeda secara optik. Studi bypass Complex III menetapkan preseden tersebut dengan mengulangi pemulihan potensial membran menggunakan safranine O dan TMRM setelah inhibisi antimycin dan myxothiazol serta memperoleh pemulihan kualitatif yang sama. Satu reporter optik adalah petunjuk. Dua reporter independen merupakan bukti.

Tiga preparasi, tiga pertanyaan berbeda

Mitokondria terisolasi, sel yang dipermabilisasi, dan sel utuh bukanlah pengaturan sensitivitas yang dapat saling dipertukarkan pada satu uji. Ketiganya merupakan konsep berbeda dengan prinsip operasional yang berbeda.

Mitokondria terisolasi mempertahankan rantai transpor elektron, membran dalam, dan mesin matriks sambil menghilangkan membran plasma, sitosol, dan arsitektur jaringan. Penghilangan tersebut memang merupakan tujuannya: substrat, ADP, inhibitor, dan konsentrasi zat warna dapat ditentukan secara tepat, sehingga suatu jalur dapat diidentifikasi. Konsekuensinya adalah hilangnya suplai substrat, pensinyalan, dan kebutuhan energi dalam keadaan asli.

Sel yang dipermabilisasi mempertahankan mitokondria di dalam sebagian besar arsitektur selulernya sambil memungkinkan substrat eksogen dan ADP melewati membran plasma yang telah dibuka. Preparasi ini merupakan alat yang tepat untuk menetapkan cacat jalur substrat dalam konteks seluler. Permabilisasi berlebihan merusak membran luar, dan regulasi sitosolik akan terbilas.

Sel utuh mempertahankan semuanya: penghalang membran plasma, reduktan sitosolik, transport substrat endogen, jaringan mitokondria, dan kebutuhan ATP. Preparasi ini paling dekat dengan fisiologi dan paling jauh dari mekanisme, karena pengambilan, reduksi, dan sekuestrasi zat warna semuanya membentuk paparan mitokondria yang efektif.

Studi TEGDMA menggunakan ketiga tingkat tersebut secara sengaja: mitokondria otak terisolasi untuk pemulihan oksidasi dan potensial oleh zat warna, sel punca pulpa gigi yang dipermabilisasi terutama untuk melokalisasi lesi pada oksidasi substrat terkait Complex I, dan sel punca utuh untuk efek bersih fisiologis zat warna 2 uM terhadap konsumsi oksigen yang ditekan. Bagi pembaca yang membandingkan pembacaan mitokondria pada berbagai preparasi, penjelasan pendamping mengenai cara metilen biru memindahkan elektron melalui rantai respirasi memberikan latar belakang jalurnya, sementara panduan membaca studi respirasi metilen biru membahas logika dosis dan inhibitor.

Kontrol yang diperlukan oleh zat warna aktif-redoks

Pengayun redoks membutuhkan daftar kontrol yang lebih panjang dibandingkan inhibitor biasa, karena kimia zat warna saja dapat meniru biologi.

Untuk respirometri, jalankan chamber hanya berisi buffer untuk mengukur drift, chamber buffer ditambah zat warna tanpa bahan biologis, zat warna ditambah reduktan ekstraseluler apa pun yang terdapat dalam uji, serta rotenon terminal ditambah antimycin untuk menentukan konsumsi oksigen nonmitokondria pada sel utuh. Perhatikan bahwa zat warna tereduksi teroksidasi kembali dengan mentransfer elektron ke oksigen untuk membentuk hidrogen peroksida, sehingga blanko hanya zat warna tanpa donor elektron meremehkan sink oksigen bebas sel yang muncul setelah NADH atau NADPH tersedia.

Untuk hidrogen peroksida, pilih Amplex UltraRed terkalibrasi ditambah horseradish peroxidase daripada zat warna DCFDA yang tidak selektif, verifikasi dengan katalase, dan uji ketergantungan terhadap iluminasi, karena zat warna ini merupakan fotosensitizer. Studi mitokondria otak menemukan bahwa beban peroksida meningkat lebih dari empat kali lipat hanya pada zat warna 100 nM sementara eliminasi melambat, dengan peroksida dibentuk langsung oleh zat warna tereduksi tanpa intermediat superoksida. Rincian mengenai pemilihan probe dan kontrol cahaya dibahas dalam artikel pendamping tentang mengukur spesies oksigen reaktif dalam eksperimen zat warna, sementara pertanyaan yang lebih luas mengenai kapan peroksida bertindak sebagai sinyal versus beban dibahas bersama keseimbangan redoks seluler dan klaim antioksidan.

Untuk klaim jalur, uji kedua lokasi inhibitor Complex III: antimycin A pada lokasi Qi dan myxothiazol pada lokasi Qo, ditambah titik akhir Complex IV menggunakan sianida. Sebuah studi otak tikus yang lebih awal melaporkan pemulihan respirasi yang diblokir rotenon tetapi tidak yang diblokir antimycin oleh zat warna, sementara studi tiga spesies yang lebih baru menemukan pemulihan parsial dengan kedua inhibitor serta bukti reduksi langsung cytochrome c. Perlakukan bypass sebagai sesuatu yang konsisten dengan data yang lebih baru, bukan sebagai mekanisme yang sudah pasti, karena konsentrasi zat warna, lokasi inhibitor, keadaan substrat, dan distribusi zat warna semuanya menggeser rute yang teramati.

Matriks pemilihan uji

Gunakan tabel ini untuk memilih pengukuran berdasarkan pertanyaannya, bukan sebaliknya.

Klaim minimum yang meyakinkan menjalankan konsentrasi zat warna yang sama, 100 nM, 300 nM, 1 uM, dan 2 uM, melalui fluks oksigen pada kondisi kebocoran, ADP, oligomisin, dan uncoupler, laju sintesis ATP, potensial membran dengan sebaiknya dua probe, serta pelepasan peroksida terkalibrasi dengan katalase dan kontrol bebas sel. Laporkan rangkaian yang saling terkait: fluks oksigen ditambah laju ATP ditambah ATP per oksigen ditambah potensial ditambah peroksida. Salah satu dari angka tersebut jika berdiri sendiri hanyalah sebuah pengukuran yang masih mencari makna.