Mengapa metilen biru digunakan sebagai pewarna tandingan pada pewarnaan tahan asam

Seorang teknisi memeriksa apusan sputum setelah seluruh rangkaian pewarnaan selesai. Batang merah tampak jelas di atas bidang biru, lalu laporan dikeluarkan dengan keterangan bahwa basil tahan asam terlihat. Keesokan harinya, preparat lain menunjukkan bidang biru seragam tanpa batang merah, lalu dilaporkan negatif untuk tuberkulosis. Salah satu laporan ini menyimpulkan lebih dari yang didukung oleh preparat, dan ini bukan pertama kalinya.

Kebingungannya bersifat konseptual. Teknisi tersebut memperlakukan pewarna biru sebagai bagian dari kimia deteksi, seolah-olah metilen biru membantu menemukan mikobakteri. Tidak demikian. Saat metilen biru menyentuh preparat, pengujiannya sebenarnya sudah selesai. Pewarna tersebut hanya mewarnai latar belakang agar hasil dapat dibaca. Artikel ini menjelaskan tujuan metilen biru dalam pewarnaan tahan asam, mengapa warnanya biru dan bukan warna lain, serta kesimpulan apa yang dapat ditarik dari warna merah dengan latar biru.

Jawaban singkat

Pewarnaan tahan asam adalah uji diferensial yang dibangun dari tiga gagasan. Karbol fuksin, sebagai pewarna primer, dipaksa masuk ke setiap sel termasuk mikobakteri yang berlilin. Asam-alkohol, sebagai dekolorisator, menghilangkan pewarna merah dari sel biasa tetapi tidak berhasil mengekstraknya dari sel tahan asam. Metilen biru, sebagai pewarna tandingan, kemudian mewarnai semua bagian yang telah dikosongkan oleh dekolorisator, sehingga sel non-tahan-asam, sel pejamu, dan debris tampak biru sementara basil tahan asam tetap merah. Pewarna tandingan menyediakan kontras. Pewarna ini tidak berperan dalam kimia yang membuat suatu sel bersifat tahan asam.

Fungsi setiap tahap

Diagram di bawah menunjukkan pembagian tugasnya. Bacalah dari kiri ke kanan sebagai suatu prosedur, dan baca bagian bawah sebagai pengingat bahwa setiap kelompok metode pewarnaan mengajukan pertanyaan yang berbeda.

Penetrasi terjadi terlebih dahulu. Mikobakteri tahan terhadap pewarna berair biasa karena selubungnya sangat hidrofobik, sehingga protokol memaksa pewarna masuk. Dalam metode Ziehl-Neelsen, pemanasan dengan uap mendorong karbol fuksin yang mengandung fenol menembus dinding berlilin. Dalam metode dingin Kinyoun, panas digantikan oleh formulasi pewarna primer yang jauh lebih kuat, dan beberapa versi modifikasi tanpa panas menambahkan surfaktan. Protokol pewarnaan tahan asam American Society for Microbiology mendokumentasikan kedua formulasi tersebut secara berdampingan, dan perbedaan konsentrasinya mencolok: kira-kira 0.3 g fuksin basa per 100 mL untuk metode berpemanasan dibanding sekitar 4 g untuk metode dingin.

Diferensiasi terjadi berikutnya. Asam-alkohol, umumnya berupa 3 mL asam hidroklorida pekat dalam 97 mL etanol 95 percent, membilas pewarna merah dari setiap sel yang dindingnya tidak memberikan ketahanan khusus. Sel dengan selubung lipid mikobakteri yang utuh mempertahankan pewarna tersebut. Inilah tahap yang menentukan keseluruhan metode, sekaligus tahap yang paling sensitif terhadap teknik, seperti dibahas di bawah.

Kontras diberikan terakhir. Preparat sekarang berisi sel tahan asam merah di atas latar belakang sel yang hampir tidak berwarna setelah pewarnanya dihilangkan. Metilen biru pada 0.3 percent w/v mengembalikan visibilitas latar belakang tersebut dengan warna yang sejauh mungkin berbeda dari merah. Pewarnaan tandingan berlangsung singkat, biasanya 20 hingga 30 detik pada metode berpemanasan dan hingga beberapa menit pada sebagian varian metode dingin, dan waktunya bergantung pada protokol, bukan merupakan sifat bawaan pewarna itu sendiri.

Mengapa pewarna ini, dan mengapa biru

Metilen biru adalah pewarna basa kationik, yang berarti ion berwarnanya membawa muatan positif dan berikatan dengan permukaan bermuatan negatif pada bakteri yang telah didekolorisasi, sel pejamu, dan debris. OpenStax Microbiology menjelaskan logika muatan ini sebagai prinsip umum di balik pewarna basa. Namun, secara kimia metilen biru bukan satu-satunya pilihan di sini. Kristal violet dan safranin juga merupakan pewarna basa. Pemilihannya didasarkan pada sifat optik, bukan kimia.

Batang merah memerlukan latar belakang dengan rona yang kontras, dan biru memberikan perbedaan paling berguna terhadap merah dalam mikroskopi medan terang. Safranin akan menjadi pewarna tandingan yang buruk karena hasil akhirnya yang merah muda-merah terlalu dekat dengan karbol fuksin yang dipertahankan, sehingga mengaburkan perbedaan yang justru dibuat oleh prosedur tersebut. Kristal violet akan menghasilkan latar belakang violet gelap yang bersaing dengan basil merah tipis untuk menarik perhatian. Bukti terkuat bahwa fungsinya adalah memberikan kontras, bukan menjalankan reaksi kimia, terlihat dari kemungkinan substitusi: pewarna tandingan hijau seperti malachite green dan brilliant green digunakan dalam beberapa protokol veteriner dan protokol modifikasi, dan pengujian tetap bekerja karena setiap rona yang jelas berbeda menjalankan fungsi yang sama.

Dari sini muncul dua konsekuensi praktis. Pertama, resep standar tidak menetapkan penyesuaian pH; jangan keliru menyamakan larutan berair biasa 0.3 percent ini dengan formulasi alkali seperti metilen biru Loeffler, yang termasuk dalam konsep pewarnaan berbeda. Kedua, pewarnaan berlebihan merugikan. Literatur histologi secara khusus memperingatkan bahwa latar belakang biru yang terlalu pekat dapat menutupi basil yang jumlahnya sedikit, sehingga membanjiri preparat lebih lama daripada yang diizinkan protokol hanya mengorbankan keterbacaan tanpa memberikan manfaat.

Kimia dinding yang memungkinkan pengujian ini

Alasan asam-alkohol dapat melakukan diferensiasi terletak pada selubung mikobakteri. Inti strukturalnya adalah kompleks mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan: peptidoglikan yang terhubung dengan arabinogalaktan, dengan ujung luar yang membawa asam mikolat berantai sangat panjang, membentuk mikomembran luar kaya lipid dengan permeabilitas yang sangat rendah. Tinjauan mengenai membran luar mikobakteri menjelaskan arsitektur ini secara terperinci. Penghalang tersebut bekerja ke dua arah. Ia menghambat masuknya pewarna, sehingga penetrasi memerlukan panas atau pewarna primer yang diperkuat, dan juga menghambat ekstraksi pewarna, sehingga asam-alkohol gagal menghilangkan karbol fuksin setelah pewarna tersebut masuk. Bakteri biasa tidak memiliki selubung ini dan kehilangan pewarnanya. Karena itu, sifat tahan asam paling tepat dipahami sebagai fenomena penghalang lipid, bukan sebagai ikatan kimia fuksin dengan asam mikolat.

Kimia ini juga menjelaskan teka-teki yang umum: mikobakteri terwarnai dengan buruk dan tidak dapat diprediksi dengan metode Gram, terkadang tampak sebagai bentuk samar berbintik-bintik atau bayangan yang tidak terwarnai. Dindingnya yang hidrofobik membatasi penetrasi kristal violet. Pewarnaan tahan asam bukanlah pewarnaan Gram yang dimodifikasi. Ini adalah prinsip diferensial berbeda yang dibangun berdasarkan sifat dinding yang berbeda, sebagaimana ditunjukkan oleh perbandingan pewarnaan sederhana dengan pewarnaan Gram untuk dua metode lainnya.

Tiga metode, tiga pertanyaan

Untuk kelompok metode bakteri satu pewarna yang lebih luas, lihat atlas pewarnaan mikroskopi.

Apa yang tidak dapat dibuktikan oleh warna merah dengan latar biru

Batang merah berarti organisme mempertahankan karbol fuksin setelah perlakuan asam-alkohol. Temuan tersebut konsisten dengan Mycobacterium tuberculosis, tetapi panduan diagnostik tuberkulosis CDC secara eksplisit menyatakan bahwa mikobakteri lain juga bersifat tahan asam, sehingga identifikasi spesies memerlukan kultur dan pengujian asam nukleat, bukan warna.

Kesalahan teknik terutama terjadi di sekitar dua tahap pembilasan. Dekolorisasi yang tidak memadai membuat bahan latar belakang tetap merah dan dapat memicu pembacaan positif palsu. Dekolorisasi berlebihan menghilangkan pewarna primer yang tertahan lemah dan berkontribusi terhadap negatif palsu. Pewarna tandingan yang diaplikasikan terlalu banyak menenggelamkan basil yang jumlahnya sedikit dalam warna biru. Apusan yang terlalu tebal, reagen yang mengendap, dan air pembilas yang terkontaminasi menambahkan artefaknya masing-masing.

Sensitivitas tetap dibatasi oleh jumlah organisme, tidak peduli sebaik apa tekniknya. Mikroskopi apusan konvensional membutuhkan kira-kira 5,000 hingga 10,000 basil per milliliter sputum, dan tinjauan bukti CDC yang lebih lama menempatkan sensitivitas apusan sekitar 45 hingga 80 percent pada kasus paru yang dikonfirmasi melalui kultur. Karena itu, apusan negatif tidak pernah menyingkirkan tuberkulosis. Panduan CDC saat ini tetap menggunakan kultur bersama setiap apusan dan merekomendasikan pengujian amplifikasi asam nukleat pada setidaknya satu spesimen respiratori ketika tuberkulosis paru dipertimbangkan dan hasilnya akan mengubah penatalaksanaan.

Pekerjaan praktis harus mengikuti protokol yang diotorisasi

Deskripsi untuk tujuan pengajaran, termasuk artikel ini, tidak memberikan otorisasi untuk pekerjaan klinis. Untuk praktik di meja laboratorium, ikuti prosedur operasi standar tervalidasi milik laboratorium yang selaras dengan dokumen CDC, APHL, atau CLSI terkini; referensi pewarnaan tahan asam CDC yang disimpan dalam arsip Stacks menunjukkan bagaimana prosedur semacam itu menetapkan reagen dan hasil pembacaan. Pekerjaan dengan spesimen tuberkulosis memerlukan pengendalian biologis: apusan disiapkan dalam kabinet keselamatan biologis karena proses persiapannya menghasilkan aerosol dan percikan, dan panduan keselamatan laboratorium CDC menyatakan bahwa bahkan apusan yang telah difiksasi dengan panas masih dapat mengandung basil tuberkel hidup dan tetap harus ditangani sebagai bahan terkontaminasi. Entri CDC Public Health Image Library untuk apusan karbol-fuksin dan metilen biru yang diperiksa untuk M. leprae menjadi pengingat berguna bahwa metode ini digunakan lebih luas daripada tuberkulosis: kontras merah di atas biru yang sama digunakan di mana pun organisme tahan asam dicari, dan pembacaan negatif yang dilakukan dengan cermat juga merupakan hasil yang layak dicatat.

Membaca preparat yang telah selesai

Pewarna tandingan menunjukkan manfaatnya selama proses skrining. Saat memindai pada perbesaran rendah, seorang mikroskopis pertama-tama menggunakan latar belakang biru untuk menilai kualitas apusan: distribusi sel yang merata, sel pejamu yang utuh untuk membantu fokus, dan tidak adanya endapan berat. Kandidat berwarna merah kemudian menarik perhatian justru karena tidak ada bagian lain pada preparat yang berwarna merah. Konfirmasi dilakukan di bawah imersi minyak, tempat basil sejati menunjukkan bentuk batang tipis yang diharapkan, terkadang sedikit melengkung atau berbintik-bintik, bukan debris pewarna yang seragam.

Pewarnaan latar belakang juga menentukan kosakata dalam laporan. Preparat dengan basil merah dilaporkan sebagai basil tahan asam terlihat, sering kali disertai tingkat semikuantitatif sesuai skala laboratorium. Preparat tanpa organisme merah dilaporkan sebagai tidak ada basil tahan asam yang terlihat, bukan sebagai negatif untuk tuberkulosis. Perbedaannya penting karena bidang biru membuktikan bahwa pewarnaan berjalan, sel menyerap pewarna tandingan, dan kondisi optik memadai, tetapi tidak mengatakan apa pun tentang organisme yang jumlahnya berada di bawah batas deteksi. Bidang biru kosong merupakan hasil yang sah mengenai preparat tersebut, bukan kesimpulan mengenai pasien.

Ingat pembagian tugasnya, dan pelaporan menjadi jelas. Karbol fuksin mendeteksi kandidat. Asam-alkohol menjalankan pengujian. Metilen biru hanya membuat jawabannya dapat dibaca: merah mempertahankan pewarna saat menghadapi asam, sedangkan biru kehilangannya. Segala hal lainnya, spesies, jumlah organisme, dan makna klinis, berasal dari pemeriksaan di luar preparat.