Հոդված
Ինչպես է մեթիլենային կապույտը մտնում բջիջներ․ վերականգնում, վերաօքսիդացում և բաշխում թաղանթում
Երբ դիտում եք, թե ինչպես են էնդոթելային բջիջները փորձանոթային թասում կլանում մեթիլենային կապույտը, ակնհայտ թվացող մեկնաբանությունը միաժամանակ սխալ է։ Միջավայրը կորցնում է իր կապույտ գույնը, իսկ բջիջներում հայտնվում են կապույտ հատիկներ, ուրեմն ներկանյութը պետք է թաղանթն անցած լինի որպես կապույտ մոլեկուլ։ Փորձերն այլ բան են ասում։ Կապույտ ձևը գրեթե չի անցնում թաղանթով։ Անցնում է անգույն ձևը, իսկ ներսում տեսանելի կապույտը գոյանում է հենց ներսում՝ ներթափանցումից հետո։
Այս հակադարձ պատկերը կարևոր է, քանի որ որոշում է, թե ներկումն ինչ կարող է և ինչ չի կարող ցույց տալ։ Կապույտ հատիկները ցույց են տալիս վերաօքսիդացված և օրգանելներում պահված օքսիդացված ներկանյութը։ Դրանք չեն ցույց տալիս բջջում ներկանյութի ընդհանուր քանակը, չեն ցույց տալիս վերականգնված ձևի պաշարը և չեն չափում կենսաբանական ազդեցությունը։ Պատճառը հասկանալու համար հետևենք երեք փուլերին՝ մակերեսային վերականգնում, վերականգնված ձևի դիֆուզիա, ներբջջային վերաօքսիդացում և պահում։
Երկու ձևերն իրենց պահում են տարբեր մոլեկուլների պես
Օքսիդացված մեթիլենային կապույտը հարթ, դրական լիցքավորված օղակային համակարգ է։ Այն լուծվում է ջրում, ուժեղ կլանում է լույսը մոտավորապես 600-ից 700 նանոմետր տիրույթում և կապույտ տեսք ունի։ Այստեղ առանցքայինը լիցքն է։ Լիցքավորված, ջրասեր մոլեկուլը հեշտությամբ չի անցնում լիպիդային թաղանթով, ուստի գրականության մեջ զգուշորեն նշվում է, որ այն համեմատաբար թաղանթաանթափանց է, ոչ թե պարզապես անթափանց։
Վերականգնված մեթիլենային կապույտը, որը կոչվում է լեյկոմեթիլենային կապույտ, անգույն է, չլիցքավորված և ճարպալույծ։ Երբ լիցքը վերանում է, թաղանթը դադարում է պատ լինել։ Վերականգնված մոլեկուլը հեշտությամբ դիֆուզվում է թաղանթով, և ավելի օքսիդացնող բաժանմունք մտնելուց հետո կարող է կրկին կորցնել էլեկտրոններ ու վերադառնալ կապույտ, լիցքավորված, ներսում պահվող ձևին։ Այսպիսով, ներկանյութի օքսիդավերականգնման քիմիան նաև դրա փոխադրման մեխանիզմն է։ Էլեկտրոնների քանակը փոխելիս փոխվում է նաև թափանցելիությունը։
Առաջին փուլի էլեկտրոնները գալիս են հենց բջջից։ Կաթնասունների բջիջները պլազմային թաղանթով իրականացնում են էլեկտրոնների փոխադրում՝ վերականգնող համարժեքները ներբջջային դոնորներից դեպի դուրս՝ մակերեսային ակցեպտորներին փոխանցելով։ Պլազմային թաղանթով այս ակտիվությունը բջջի բնականոն գործառույթ է, որը հանդիպում է բջիջների տեսակների մեծ մասում։ Իսկ թիազինային ներկանյութերի հետ գործող էնդոթելային մակերեսային ռեդուկտազը մեկ հատկանշական առումով նման է մյուսներին․ այն շարունակում է աշխատել ցիանիդի և ազիդի այնպիսի դոզաների առկայությամբ, որոնք դադարեցնում են հետագա փուլերը։ Հենց այս տարանջատումն է ամբողջ պատմության առանցքը։
Բաշխման գաղափարն առաջինն էր և գրեթե բացատրում էր ներթափանցումը
1929 թվականին Ռոքֆելլերի ինստիտուտում Մարիան Իրվինն ավելի պարզ հարց առաջադրեց։ Գուցե ներկանյութի մուտքն ընդամենը ջրի և բջջի ճարպային շերտերի միջև բաշխում է, իսկ լաբորատոր պայմաններում քլորոֆորմի շերտը կարող է փոխարինել այդ ճարպային շերտերին։ Իր ներթափանցման սպեկտրոֆոտոմետրիկ ուսումնասիրություններում նա ներկանյութերի ջրային լուծույթները թափահարում էր քլորոֆորմի հետ և համեմատում օրգանական փուլ անցած նյութը կենդանի ջրիմուռների բջիջներ ներթափանցած նյութի հետ։
Այդ աշխատանքի երկու արդյունք մինչ օրս արժանի են ուշադրության։ Նախ՝ մեթիլենային կապույտի առևտրային լուծույթները պարունակում էին տրիմեթիլթիոնին, որն այժմ կոչվում է Azure B, և այդ խառնուրդն ավելի արագ էր ներթափանցում, քան բուն մեթիլենային կապույտը, հատկապես հիմնային pH-ի դեպքում, երբ գերակշռում է լիպիդալույծ ազատ հիմքի ձևը։ Մեթիլենային կապույտի թվացյալ ներթափանցման մի մասն իրականում Azure B-ի ընտրողական ներթափանցումն էր։ Երկրորդ՝ pH-ը որոշում էր արդյունքը՝ որոշելով իոնացման վիճակը, իսկ վնասված բջիջները շատ ավելի մեծ քանակությամբ ներկանյութ էին ընդունում, քան չվնասվածները։ Բաշխման գործակիցներն ու լիցքային վիճակը որոշում էին, թե ինչ են կլանում արհեստական համակարգն ու կենդանի բջիջը, և երկուսի նմանությունը աջակցում էր բջջի սահմանում ոչ ջրային շերտերի առկայության գաղափարին։
Մոդելը հեռատես էր լիպիդների և իոնացման հարցում, բայց չէր կարող տարբերակել իր սկզբնական ձևով բաշխվող ներկանյութը այն ներկանյութից, որը մակերեսին քիմիապես փոխակերպվում է, թաղանթն անցնում այլ ձևով և ներսում կրկին վերափոխվում սկզբնական ձևին։ Այդ տարբերակման համար այլ փորձ էր անհրաժեշտ, որն իրականացվեց յոթանասուն տարի անց՝ թոքերի էնդոթելում։
Վերականգնում՝ դրսում, պահում՝ ներսում
Մերկերն ու գործընկերներն աշխատում էին տավարի թոքային զարկերակի էնդոթելային բջիջների մշակույթների հետ և առաջարկեցին եռափուլ հաջորդականություն․ օքսիդացված ներկանյութը բջջի մակերեսին վերականգնվում է մինչև իր անգույն լիպոֆիլ ձևը, վերականգնված ձևը դիֆուզվում է ներս, իսկ ներբջջային վերաօքսիդացումը վերականգնում է թաղանթաանթափանց օքսիդացված ձևը, որը կուտակվում է։ Այնուհետև իրենց էնդոթելային բջիջների կողմից թիազինային ներկանյութերի կլանման ուսումնասիրությունում նրանք ստուգեցին այդ հաջորդականությունը՝ փորձելով ընդհատել այն որոշակի կետերում։
Առաջին գործիքը ֆերիցիանիդն էր՝ էլեկտրոնների ակցեպտոր, որը չի կարող մտնել բջիջ։ Երբ մակերեսային ֆերմենտները բջջից դուրս կապույտ ներկանյութը վերականգնում են մինչև անգույն ձևը, ֆերիցիանիդը կարող է հետ վերցնել այդ էլեկտրոնները՝ միջավայրում կրկին առաջացնելով կապույտ ներկանյութ, նախքան այն կհասցնի անցնել թաղանթով։ Քանի դեռ ֆերիցիանիդն առկա էր ավելցուկով՝ 10 միկրոմոլար ներկանյութի դիմաց 50-ից 500 միկրոմոլար ֆերիցիանիդ, ներկանյութի կլանումը գրեթե դադարում էր, և միայն ֆերիցիանիդի սպառումից հետո էր վերականգնվում բնականոն արագությամբ։ Կինետիկան նույն պատկերը ցույց տվեց նաև մեկ այլ եղանակով։ Ֆերիցիանիդը անհետանում էր մոտավորապես հաստատուն արագությամբ, ինչը համապատասխանում էր մակերեսային վերականգնման կայուն հոսքին, որը սնուցում էր բազմակի շրջանառվող միջնորդին, մինչդեռ արտաբջջային ներկանյութն անհետանում էր էքսպոնենցիալ կերպով՝ իր պաշարի նվազմանը զուգընթաց։ Հաստատուն հոսքն ու նվազող պաշարը միասին նշանակում են, որ ֆերիցիանիդի ազդանշանը ցույց է տալիս շարունակական վերականգնումը, ոչ թե ներկանյութի մոլեկուլների հեռացումը լուծույթից։
Երկրորդ գործիքն ամբողջությամբ վերացրեց թաղանթն անցնելու փուլը։ Խումբը թիազինային շարքի մերձավոր ներկանյութ՝ տոլուիդինային կապույտ O-ն, միացրեց մեծ պոլիակրիլամիդային շղթայի, որը չափազանց մեծ էր բջիջ մտնելու համար՝ օքսիդացման ցանկացած վիճակում։ Բջիջները, միևնույն է, վերականգնում էին այդ կապակցված ներկանյութը։ Հետևաբար վերականգնման համար ներբջջային հասանելիություն անհրաժեշտ չէ։ Այդ գործընթացն իրականացնող համակարգը գտնվում է մակերեսին կամ էլեկտրականորեն կապված է դրա հետ։
Այնուհետև կատարվեց այն տարանջատումը, որից բխում է հոդվածի վերնագիրը։ Ցիանիդն ու ազիդը՝ 2 միլիմոլար կոնցենտրացիայով, ուժեղ ճնշում էին ներկանյութի կուտակումը, իսկ մանրադիտակի տակ մուգ կապույտ և մանուշակագույն ներառուկները, որոնք սովորաբար օղակում են կորիզը, գրեթե անհետանում էին։ Սակայն արգելակիչներից ոչ մեկը չէր դանդաղեցնում արտաբջջային վերականգնումը․ ֆերիցիանիդի շրջանառությունը շարունակվում էր առանց նվազման, իսկ չներթափանցող պոլիմերը դեռ վերականգնվում էր։ Արգելակումը վերաբերում էր հետագա փուլերին։ Ցիանիդն ու ազիդը դադարեցնում էին ներբջջային վերաօքսիդացումն ու մեկուսացված պահումը, ոչ թե մակերեսային վերականգնումը։ Կենսունակության վերահսկիչ փորձերը հաստատում էին այս մեկնաբանությունը, քանի որ այդ մշակումների ընթացքում բջիջները պահպանում էին իրենց ցիտոզոլային մարկերային ֆերմենտը՝ լակտատդեհիդրոգենազը։ Այսինքն՝ կլանման նվազումը պարզապես թունավորման կամ թաղանթի պատռման հետևանք չէր։
Հոդվածում նշված մեկ վերապահում դեռ ուժի մեջ է։ Կապույտ ներառուկները գտնվում էին կորիզի շուրջ, բայց ոչ դրա ներսում, ինչը համապատասխանում է ենթաբջջային օրգանելներում օքսիդացմանը, սակայն ուսումնասիրությունը չէր որոշել, թե կոնկրետ որ օրգանելներում։ Այլ տեսակի բջիջներում նման պատկերները թույլ ապացույցների հիման վրա անվանվել էին լիզոսոմային։ Ներկանյութի ներսում պահումը համարեք հաստատված, իսկ դրա ճշգրիտ տեղակայումը՝ նախնական։ Էլեկտրոնների հետագա ուղին հետևող ընթերցողները կարող են շարունակել միտոքոնդրիալ էլեկտրոնային փոխադրման և օքսիդավերականգնման գործընթացների մասին հոդվածով և ներմուծման ուղուց կախված ներծծման ու բաշխման ավելի լայն պատկերով։
Ներկումը ազդեցությանը ենթարկվածության չափանիշ չէ
Երրորդ ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, թե ինչ է տեղի ունենում, երբ ներթափանցման այս տրամաբանությունը համադրվում է կենսաբանական ցուցանիշի հետ։ Սքոթն ու գործընկերները պարզեցին, որ մեթիլ-բետա-ցիկլոդեքստրինը՝ օղակաձև տորուսի կառուցվածքով շաքարը, ուղղակիորեն կապվում է մեթիլենային կապույտին։ Ներառման համալիրի ասոցիացիայի հաստատունը մոտ 310 էր մեկ մոլարի հաշվով՝ ներկանյութի դիմերացման մոտ 5846-ի դիմաց՝ մեկ մոլարի հաշվով։ L929 ֆիբրոբլաստներում այս կապումը արգելակում էր և՛ բջիջների ներկումը, և՛ գլյուկոզի կլանման խթանումը․ ցիկլոդեքստրինով նախնական ինկուբացումը կանխում էր կապույտ ներկումը, իսկ դրա հետագա ավելացումն արագացնում էր գունազրկումը։ Երբ օպտիկական կապույտ ազդանշանը վերանում էր բջիջներից, ակտիվացված գլյուկոզի փոխադրումը թուլանում էր սերտորեն զուգահեռ ընթացքով։
Հեղինակները մեկնաբանեցին այս համահարաբերությունը որպես փաստարկ հօգուտ ներկանյութի և գլյուկոզի փոխադրիչի ակտիվացման ուղու որևէ սպիտակուցի միջև ուղղակի փոխազդեցության, այլ ոչ թե երկարատև օքսիդատիվ սթրեսի մեխանիզմի։ Այդ եզրահանգումը ողջամիտ է, բայց սահմանափակ։ Փորձը չի նույնականացնում սպիտակուցը, չի ցույց տալիս կապում հենց փոխադրիչին, իսկ գունազրկման և ազդեցության կորստի համահարաբերությունը չի կարող բացառել օքսիդավերականգնմամբ միջնորդավորված բոլոր ուղիները։
Հիմնական դասը վերաբերում է չափմանը։ Օպտիկական ներկումը ցույց է տալիս տեսանելի, օքսիդացված, բջջի հետ կապված ներկանյութը։ Այն ամբողջությամբ բաց է թողնում անգույն վերականգնված ձևի պաշարը, ուստի թույլ գունավորված բջիջը դեռ կարող է պարունակել ներկանյութի համարժեքներ, իսկ ինտենսիվ ներկված բջիջը վկայում է ներսում պահված օքսիդացված ներկանյութի մասին, ոչ թե հյուսվածքի՝ ներկանյութի ազդեցությանը ենթարկվածության ընդհանուր մակարդակի կամ ազդեցության մեծության։ Նույն զգուշացումը կիրառելի է նաև ավելի մեծ մասշտաբում․ տարբեր տեսակի բջիջների ներկումը համեմատելը կամ հյուսվածքի մուգ կտրվածքը որպես ավելի բարձր ենթարկվածության ապացույց ընդունելը կրկնում է թասի դիտարկման սկզբնական սխալը։ Կլանումը վերականգնման, դիֆուզիայի և վերաօքսիդացման ցիկլ է, իսկ կապույտ ձևի ցանկացած առանձին պահի պատկերը ցույց է տալիս դրա միայն մի մասը։ Սրանից անմիջապես բխում են գործնական հետևանքները լաբորատոր ներկման և աշխատակարգերի, ինչպես նաև դոզայի և ազդեցությանը ենթարկվածության վերաբերյալ պնդումների մեկնաբանման համար։