Megkerülheti-e a metilénkék a mitokondriális III-as komplexet? Miért térnek el a vizsgálatok eredményei?

Két laboratórium azt vizsgálta, hogy a metilénkék meg tudja-e kerülni a gátolt mitokondriális III-as komplexet. Az egyik válasza nem volt. A másiké igen. Mindkettőt adatok támasztották alá.

Az első vizsgálat egéragy-mitokondriumokban azt találta, hogy a festék erre nem képes. A második, három rágcsálófaj agyi mitokondriumain végzett vizsgálat szerint részben képes rá. Egy harmadik, egérmájon végzett vizsgálatot gyakran idéznek velük együtt, de az mást vizsgált. Ha ezt a helyén kezeljük, a zavar fele eloszlik.

Nem jelenthetünk ki egyetlen általános érvényű mechanizmust. Három kísérletről van szó, eltérő gátlószerekkel, dózisokkal és mérési végpontokkal. Először a körülményeket nézzük meg. A következtetések ezekből adódnak.

Mit jelent itt a megkerülés?

Az elektronok az I-es komplexen keresztül, NADH-ból, vagy a II-es komplexen keresztül, szukcinátból lépnek be a láncba, majd a III-as komplexen át jutnak a citokróm c-hez, végül a IV-es komplexen keresztül az oxigénhez. A sejt az út során kialakuló gradienst használja fel ATP előállítására.

A megkerülésre vonatkozó állítás szerint a metilénkék a gátlás helye előtt felveszi az elektronokat, majd utána adja le őket. Az oxidált festék NADH-ból vagy a lánc korai komponenseiből vesz át elektronokat, és leukometilénkékké alakul. A redukált forma ezután a citokróm c-nek adja át őket, vagy visszajuttatja a láncba. Ha az átadás a gátlás helye után történik, a légzés és a membránpotenciál részben helyreáll. Ha a gátlás helyén vagy előtte, egyik sem áll helyre.

A III-as komplex egyik sajátossága nagyrészt meghatározza ezt a vitát. A komplex Q-ciklust működtet, két inhibitorkötő hellyel. Az antimycin a Qi-helyhez kötődik. A myxothiazol a Qo-helyhez. Az a vizsgálat, amely csak az egyiket használja, a komplexnek csak az egyik felét teszteli.

Első vizsgálat: nincs megkerülés egéragy-mitokondriumokban

Gureev és munkatársai C57BL/6 egerek agykérgéből származó, digitoninnal izolált mitokondriumokat használtak, 0.1 mg per ml fehérjekoncentráció mellett. Három szubsztrát-összeállítást vizsgáltak: piruvátot és malátot, mindkettőt 5 mM koncentrációban; szukcinátot 10 mM és glutamátot 2 mM koncentrációban; valamint L-prolint 10 mM koncentrációban. A gátlószerek rotenone volt 1 micromolar koncentrációban az I-es komplexhez, és antimycin 1 microgram per ml koncentrációban a III-as komplexhez. A festéket 0.5, 1 és 2 micromolar koncentrációban alkalmazták, a fő koncentráció 1 micromolar volt. A módszerek és a mérési görbék a FEBS Letters közleményében találhatók.

Az I-es komplex megkerülése működött. A rotenone az ADP által serkentett légzést körülbelül 121-ről körülbelül 2 nmol per minute per mg értékre csökkentette, az 1 micromolar koncentrációjú festék pedig körülbelül 21-re állította vissza. A membránpotenciál piruvát és malát, valamint L-prolin mellett is helyreállt.

A III-as komplex megkerülése nem működött. Az antimycin körülbelül 16-ra csökkentette a légzést, a festék pedig csak körülbelül 20-ra emelte. A membránpotenciál egyik szubsztrát mellett sem állt helyre, még 5 micromolar festékkoncentrációig sem. A peroxidra vonatkozó adatok ugyanerre utaltak: a festék önmagában a körülbelül 76 pmol per minute per mg alapértékről a három dózisnál nagyjából 1170, 1460 és 1945 értékre emelte a peroxidkibocsátást, az antimycin azonban ezt a festék által kiváltott jelet rendre körülbelül 25, 88 és 96 százalékkal csökkentette. Ha a redukált festék közvetlenül az oxigénnel reagálna, a III-as komplex gátlása nem csökkenthetné a jelet. A szerzők arra következtettek, hogy a redukált festék a III-as komplex Qo-helyén, az antimycin által okozott gátlás előtt oxidálódik. A rövid út szavakkal: a donoroktól a festékhez, a festéktől a Qo-helyhez, majd tovább a szokásos útvonalon. A rotenone gátlása megkerülhető. Az antimyciné nem.

Második vizsgálat: részleges megkerülés három fajban, mindkét inhibitorkötő helyen

Svab és munkatársai kibővítették a kísérleti elrendezést. Egerek, patkányok és tengerimalacok agyi mitokondriumait használták, Percoll-izolálással, ugyanazon a 0.1 mg per ml koncentráción, piruvát és malát vagy glutamát és malát mellett, mindegyikből 5 mM koncentrációval. Két III-as komplexet gátló szert alkalmaztak: antimycin A-t 0.3 micromolar és myxothiazolt 1 micromolar koncentrációban. A festék koncentrációja a legtöbb mérésnél 2 micromolar volt, a citokróm c-t vizsgáló kísérletekben 0.5. Mindhárom faj azonos protokollal végzett vizsgálata megtalálható a szabadon hozzáférhető tanulmányban.

Mindkét gátlás részben megkerülhető volt, mindhárom fajban. Egér-mitokondriumokban az antimycin csökkentette a légzést, a festék pedig körülbelül 60 százalékkal emelte, nagyjából 37-ről 59 nmol per minute per mg értékre. A myxothiazol 88 százalékkal, körülbelül 4.5-re csökkentette, a festék pedig ötszörösére, körülbelül 23-ra emelte. A membránpotenciál mindkét inhibitor mellett részben repolarizálódott. Ezt két festékkel, szafranin O-val és ratiometrikus TMRM-mel mérték, hogy kizárják az optikai műtermékeket.

Ez a tanulmány az elektronátadást közvetlenül is vizsgálta, amit az első vizsgálat nem tett meg. Az energiával ellátott mitokondriumok a kívülről hozzáadott, 25 micromolar koncentrációjú acetilált citokróm c-t sem inhibitorokkal, sem nélkülük nem redukálták, a festék hozzáadása viszont mindkét esetben redukciót váltott ki. Sejtmentes pufferben a NADH és a festék együtt a NADH-val arányos sebességgel redukálta a citokróm c-t. A hosszabb ugrás szavakkal: redukáló ekvivalensek a festékhez, a festék közvetlenül a citokróm c-hez, majd a IV-es komplexen át az oxigénhez. Ez az út teljesen kihagyja a III-as komplexet, ezért mindkét gátlószer megkerülhető.

Két további mérési eredmény is alátámasztja ezt az értelmezést. A myxothiazollal kezelt mitokondriumokhoz adott festék hatására csökkent a NAD(P)H fluoreszcenciája, vagyis a redukáló ekvivalensek az új útvonalon távoztak. A festék 660 nm-nél mért abszorbanciája pedig sorban követte az egyes hozzáadásokat, miközben a centrifugált minták felülúszói azt mutatták, hogy az oxidált festék több mint százszoros mértékben dúsult az energiával ellátott mitokondriumokban, majd a potenciál összeomlásakor távozott belőlük. A protonmérleg is illeszkedik ehhez: a protonpumpáló lépések kihagyása miatt elektronpáronként 10 helyett nagyjából 2 proton marad. Ezért a gyorsabb oxigénfelhasználás csupán részleges repolarizációval valódi megkerülésre jellemző, nem pedig ellene szóló bizonyíték.

Ugyanez a preparátum olyan válaszokat adott, amelyek könnyen félrevezetik a felületes olvasót. Inhibitor és festék jelenlétében az ADP nem növelte, hanem csökkentette a légzést, a transzport gátlása pedig nem lassította, hanem serkentette, miközben a membránpotenciál továbbra is a szokásos irányokba változott. Ebben a rendszerben az oxigénfogyasztás önmagában félrevezető.

Harmadik vizsgálat: a májvizsgálat, amely az I-es és II-es komplexet tesztelte, nem a III-ast

Lee és Boelsterli egérmáj-mitokondriumokat és tenyésztett májsejteket használtak, amelyeket efavirenzzel károsítottak az I-es komplexnél, körülbelül 30 micromolar IC50 mellett, illetve az izoniazid metabolitjával, hidrazinnal a II-es komplexnél, szintén körülbelül 30 micromolar IC50 mellett. A körülbelül 30 micromolar koncentrációjú festék helyreállította a NADH oxidációját, a membránpotenciált és az ATP-t, miközben csökkentette az oxidánsokat és a nekrotikus sejthalált. A Redox Biology tanulmánya ezt úgy modellezi, hogy a festék a károsodott I-es és II-es komplexet megkerülve szállítja az elektronokat.

Ez az eredmény a lánc korábbi szakaszára vonatkozó, tisztázott háttérinformáció. A III-as komplexről semmit sem mond, mert azt ebben a vizsgálatban nem gátolták. Egyik agyi vizsgálatot sem erősítheti meg vagy cáfolhatja.

A kísérleti körülmények mátrixa

Négy ok, amiért a III-as komplex mindkét vizsgálata helyes lehet a saját elrendezésében

1. A gátlószer nem ugyanazt a beavatkozást jelentette. Az egyik oldalon antimycin önmagában, 1 microgram per ml koncentrációban; a másikon antimycin 0.3 micromolar koncentrációban, valamint egy külön Qo-helyet gátló szer. A festéket a Qo-helyhez vezető út pontosan ott vall kudarcot, ahol a közvetlenül a citokróm c-hez vezető út működik. Egyetlen hely vizsgálata nem helyettesítheti mindkettőét.

2. A festékdózis és az időzítés eltért. A fő koncentrációk 1, illetve 2 micromolar voltak egy olyan redoxciklusban részt vevő vegyületnél, amelynek felvétele és közvetlen citokróm c-redukciója koncentráció- és időfüggő. Kis dóziskülönbségek és eltérő mérési időpontok ugyanannak a hálózatnak más-más ágait tehetik láthatóvá.

3. A preparátumok eltértek. A digitoninos izolálás és a Percoll-gradienses izolálás egymással átfedő, de nem azonos mitokondriumpopulációkat választ ki. A fehérjekoncentráció mindkettőnél 0.1 mg per ml volt, így ez a változó kizárható, az alpopuláció és az épség viszont nem. A fajkülönbség gyanúját is elvetették: a második csoport egérben is reprodukálta a megfigyelt jelenséget.

4. A szubsztrátok határozzák meg, mire képes a festék. Három szubsztrát-összeállítás áll szemben a NADH-hoz kapcsolt párokkal. A NADH-ellátás és a membránpotenciál együtt határozza meg, milyen gyorsan redukálódik a festék, és hogyan oszlik meg. Az az útvonal pedig, amelyhez redukált festéknek kell jelen lennie oxidált citokróm c mellett, ettől a választástól függ.

Hogyan értékeljük a következő, megkerülésről szóló állítást?

Kérdezzük meg, melyik komplexet gátolták, melyik inhibitorral, melyik helyen és milyen dózissal. Kérdezzük meg a festék koncentrációját és a mérés időpontját. Kérdezzünk rá a szövetre, a fajra, az izolálásra, a fehérjekoncentrációra és a szubsztrátra. Arra is kérdezzünk rá, hogy összhangban van-e a potenciál, a légzés, a redoxállapot és a közvetlen elektronátadási vizsgálat eredménye, mert itt az oxigénfogyasztás önmagában többször is téves irányba mutatott.

A szűken megfogalmazott összegzés továbbra is érvényes. Az I-es komplex festékkel történő megkerülésében egyetértés van. A III-as komplex esetében az egér-mitokondriumok 1 microgram per ml antimycin és 1 micromolar festék mellett nem mutatnak funkcionális megkerülést. Ezzel szemben három faj mitokondriumai 0.3 micromolar antimycin vagy 1 micromolar myxothiazol és 2 micromolar festék mellett részleges megkerülést mutatnak, közvetlen elektronátadással a festéktől a citokróm c-hez. Ezek a mondatok egyszerre igazak lehetnek. Minden ennél tágabb állítás extrapoláció.

A kapcsolódó olvasnivalók a vitatott állítást a nem vitatott kémiai háttér keretei között tartják: hogyan mozgatja az elektronokat a metilénkék az elektronátadásról, az I-es komplex megkerülését vizsgáló kísérletek a lánc korábbi szakaszának tisztázott esetéről, a membránpotenciál mérései és műtermékeik arról, miért volt szükség két festékre, valamint a redoxciklusban részt vevő vegyületek laboratóriumi kezelése a dózis és az időzítés buktatóiról.