Metilénkék és sclerosis multiplex: mit vizsgáltak az állatkísérletek?

Ha a metilénkék SM-ben való alkalmazására keresünk rá, olyan tanulmányokat találunk, amelyek látszólag ugyanarra a kérdésre válaszolnak. Valójában nem. Az egyik tanulmányban beteg egereknek adtak metilénkéket kezelésként. A másikban egyetlen állatot sem kezeltek vele. A metilénkéket kék színezékként használták vékony gerincvelőmetszeteken, hogy a patológus mikroszkóp alatt láthassa a mielint.

Ez a különbség az egész cikk alapja. A festéknek két szerepe van a biológiában, és ezekben az üvegen kívül semmi közös nincs. Gyógyszerjelöltként élő állatnak adagolják, és azt vizsgálják, változik-e a betegség. Szövettani festékként a kísérlet után elhalt, fixált szövetre viszik fel, és azt vizsgálják, milyen volt a szövet állapota. Ha ezt a különbséget figyelmen kívül hagyjuk, a patológiai módszereket ismertető részt kezelési eredményként fogjuk olvasni.

Mi az EAE, közérthetően?

A kísérletes autoimmun encephalomyelitis, szokásos rövidítésével EAE, a sclerosis multiplex bizonyos jellemzőinek bevett állatmodellje. A kutató egy fogékony egeret egy mielinfehérje fragmentumával és egy erős adjuvánssal immunizál. Az immunrendszer ezután megtámadja az állat saját központi idegrendszerét. Az egérnél felfelé terjedő gyengeség alakul ki, amely könnyen pontozható egy 0 és 5 közötti skálán, a petyhüdt faroktól a hátsó végtagok bénulásáig.

Ez az egyszerű pontozhatóság megmagyarázza, miért népszerű az EAE, és azt is, miért lehet félrevezető. Az emberi SM spontán alakul ki, szélesebb és kevésbé pontosan meghatározott célpontokat érint, és látási, érző, kognitív, kisagyi és motoros tüneteket okoz relapszáló vagy progresszív lefolyással. Az EAE ellenőrzött körülmények között reprodukál bizonyos mechanizmusokat, például a gyulladást, a demielinizációt és az axonkárosodást. Nem az SM kicsinyített mása. Az általános összefüggések iránt érdeklődő olvasóknak érdemes áttekinteniük, hogyan feltételezik a metilénkék sejtszintű hatását, mielőtt bármely egyedi, betegséggel kapcsolatos állítást megítélnének.

Az alábbi két tanulmány eltérő EAE-antigéneket is használt, ami fontos különbség. A kezelési vizsgálatban a betegséget MOG35-55-tel, a mielin-oligodendrocita-glikoproteinből származó rövid peptiddel váltották ki. A patológiai vizsgálatban MP4-et használtak, amely a mielin bázikus fehérje és a proteolipid fehérje szakaszainak fúziója. A törzs és az antigén megválasztása befolyásolja, hol jelennek meg az elváltozások, és hogyan viselkedik a gyulladás, ezért a két vizsgálat nem ugyanannak a kísérletnek két ismétlése.

Áttekintés: a modelltől a kérdésen át a korlátokig

Tartsa kéznél ezt a táblázatot. Ez a cikk alapvető hivatkozási pontja. Minden sor megmutatja, mely klinikai kérdés vizsgálatára alkalmas a modell, mit mértek ténylegesen, és hol ér véget az eredmények emberre való átültethetősége.

Bárki, aki a következő hangzatos címet ellenőrzi, ugyanezeket az oszlopokat használhatja a preklinikai vizsgálatok értelmezéséről szóló útmutató segítségével: kérdezzen rá a fajra és az antigénre, a vegyület szerepére, a végpontokra, valamint arra, hogy az eredmény a betegség lefolyását vagy a szövet egy adott időpontban rögzített állapotát mutatja-e.

A kezelési eredmény: mit változtatott meg az adagolás?

A Journal of Neuroimmunology folyóiratban megjelent 2016-os kezelési vizsgálat körülbelül 8 és 10 hetes kor közötti nőstény C57BL/6 egereket használt, amelyeket egérenként 250 mikrogramm MOG35-55-tel immunizáltak. A betegség kiváltása után az EAE-s állatokat véletlenszerűen metilénkékkel kezelt vagy kezeletlen EAE-csoportba osztották, és klinikai pontszámaikat körülbelül a 30. napig követték.

A kezelt egerek klinikai pontszámai a 15. naptól a 30. napig szignifikánsan alacsonyabbak voltak az EAE-kontrollokénál, P kisebb mint 0.01 mellett. A gerincvelő elemzése ugyanebbe az irányba mutatott: a kezelt állatoknál kisebb volt a gyulladásos beszűrődés, a demielinizáció és az axonvesztés.

A vizsgálat sajátosságát a jelátviteli mutatók adták. A kezelés fokozta az AMPK aktivációját és a SIRT1 expresszióját, és visszaszorította az NF-kB, a gyulladás egyik központi szabályozójának aktivációját. Az adaptív immunitás oldalán csökkentette a Th17-választ és erősítette a Treg-választ. A feltételezett láncolat tehát a következő: metilénkék, majd AMPK és SIRT1, majd csökkent NF-kB-jelátvitel, majd eltolódás a gyulladásos Th17-választól a szabályozó Treg-válasz felé, majd enyhébb szövetkárosodás, végül alacsonyabb pontszámok.

Ez a láncolat értelmezés, nem bizonyított oksági sorrend. A vizsgálat azt mutatja, hogy a gyógyszer alkalmazása, a jelátviteli változások és a betegség javulása együtt jártak. Nem bizonyítja, hogy a teljes kedvező hatást az AMPK és a SIRT1 közvetíti, és a nyilvánosan indexelt szöveg nem adja meg a pontos, milligramm/testtömegkilogrammban kifejezett dózist, a beadás módját, a kezdőnapot vagy az időtartamot olyan egyértelműen, hogy a kezelési séma pusztán az összefoglalóból reprodukálható legyen. Az értékesítési oldalakon e tanulmányra hivatkozva közölt adagolási számokat tekintse ellenőrizetlennek, hacsak nem hivatkoznak a teljes szöveg módszertani részére. A metilénkékre vonatkozó szélesebb körű humán bizonyítékok között érdemes ellenőrizni, hogy ez a korai immunológiai jelzés eljutott-e valaha klinikai adatokig.

A patológiai eredmény: mit mutatott a szövet hat hónap alatt?

A PLoS ONE folyóiratban megjelent 2015-ös MP4-vizsgálat nőstény C57BL/6 egereket használt, amelyeket 200 mikrogramm MP4-gyel, komplett Freund-adjuvánsban immunizáltak, és pertussistoxint is kaptak az immunizálás napján, majd 48 órával később ismét. Egyetlen állat sem kapott metilénkéket gyógyszerként. Fixálás és beágyazás után az egy mikrométeres keresztirányú gerincvelőmetszeteket metilénkékkel festették meg fénymikroszkópos vizsgálathoz, a finomabb részleteket pedig a ventrolaterális köteg elektronmikroszkópos vizsgálatával elemezték.

Három szakaszban vettek szövetmintát: az akut csúcsponton 7 egérből, a kezdet után három hónappal 5 egérből, a kezdet után hat hónappal pedig 10 egérből. Az átlagos klinikai pontszámok ezekben a szakaszokban szinte azonosnak tűntek, a 0 és 5 közötti skálán körülbelül 1.7 és 1.8 között voltak. A szövet más képet mutatott. Az izolált mielinkárosodás négyzetmilliméterenként körülbelül 569,000 rostról az akut csúcsponton körülbelül 1,496,000 rostra emelkedett hat hónapra; az akut és a hosszú távú állapot összehasonlítása szignifikáns volt, P = 0.027 mellett. Az együttes mielin- és axonkárosodás hat hónapra nagyjából megkétszereződött. A remielinizálódó rostok aránya minden szakaszban egy százalék alatt maradt, ami kijózanító részlet a helyreállításba vetett remények szempontjából.

Az axonkárosodás U alakú mintázatot követett: magas volt az akut csúcsponton, alacsonyabb három hónapnál, és a legmagasabb hat hónapnál; emellett összefüggött a mitokondriális duzzadással és a neurofilamentumok közötti távolság csökkenésével. Az értékelést a pontszám és a betegségszakasz ismerete nélkül végezték, ami megerősíti azt az értelmezést, hogy a klinikai pontszámok alulbecsülték a folyamatos szerkezeti károsodást.

Ez az eltérés a vizsgálat valódi hozzájárulása az SM iránt érdeklődő olvasó számára. A stabil funkciókárosodási pontszám nem jelentett stabil szöveti állapotot. Azt is megmutatja, miért nem támaszthat alá ez a tanulmány semmilyen állítást a metilénkék SM-ben kifejtett kezelési hatásáról. Az idő hatását vizsgálta, nem egy kezelését.

Miért nem bizonyít egyik vizsgálat sem előnyt a betegeknél?

Tekintsen mindkét tanulmányra úgy, mint amely egy szűk kérdésre jól válaszol, a betegekre vonatkozó kérdésre viszont egyáltalán nem.

Először is, az ok eltér. Az EAE-t szándékosan váltják ki meghatározott antigénnel és adjuvánssal. Az emberi SM spontán alakul ki, és szélesebb immunológiai repertoárt érint, amelybe a T-sejtek, a B-sejtek, a veleszületett immunitás és a helyben található gliasejtek is beletartoznak. Az a vegyület, amely egy egérben módosítja a MOG-ra hangolt választ, nem feltétlenül módosítja ezt a szélesebb emberi választ.

Másodszor, a fenotípus eltér. Az egér farkától a hátsó végtagjai felé terjedő gyengeség kényelmesen mérhető mutató. Egyetlen motoros pontszámba sűríti az emberi SM sokféleségét. A gyógyszerek gyakran megváltoztatják a rövid távú EAE-pontszámokat anélkül, hogy az emberi betegség lefolyását befolyásolnák; ezért az EAE szűrésre és mechanizmusok vizsgálatára szolgáló eszköz, nem egy kicsinyített klinikai környezet.

Harmadszor, az expozíció és az időzítés tisztázatlan. Egy 30 napos egérkísérlet korán megkezdett, folyamatos adagolása nem azonos a tartós szájon át történő alkalmazással egy már kialakult betegséggel élő embernél, és egyik vizsgálat sem mérte a gyógyszer szintjét az idegrendszerben. E kapcsolat nélkül nincs átvezetés a laboratóriumi lemezen alkalmazott koncentrációtól vagy az egérnek adott dózistól egy emberi kezelési sémához.

Negyedszer, a két tanulmány nem ismétli meg egymás eredményeit. Eltérő antigének, eltérő kérdések, eltérő végpontok, és az egyik esetben semmilyen kezelés nem történt. Két pozitív SM-kezelési vizsgálatként együtt idézni őket kategóriahiba.

Mit jelent ez a bizonyítékokat mérlegelő olvasók számára?

Ezekben a tanulmányokban nincs megalapozott metilénkék-kezelési protokoll SM-re. A kezelési vizsgálat az AMPK, a SIRT1, az NF-kB és a Th17–Treg-egyensúly további kutatását támogatja MOG EAE-ben. A patológiai vizsgálat arra emlékeztet, hogy a szövetkárosodás előrehaladhat, miközben a pontszámok változatlannak látszanak, és hogy a módszertani részben szereplő metilénkék olykor festékesüveget jelent, nem gyógyszeres szekrényt. A folyamatban lévő sclerosis multiplex-kutatásokat követő olvasóknak szem előtt kell tartaniuk a festék és a gyógyszer közötti különbséget. A biztonsági kérdéseket, köztük a vért érintő kockázatokat és a kölcsönhatások veszélyeit, orvossal kell megvitatni a metilénkék általános biztonsági adatai mellett, mielőtt bárki laboratóriumi eredményekről szóló hírek alapján cselekedne.

A lényeg egyetlen mondatban összefoglalható. Az egyik idézett vizsgálatban metilénkéket adagoltak MOG EAE-s egereknek, és enyhébb betegségről, valamint gyulladáscsökkentő irányú immunológiai eltolódásról számoltak be, míg a másik idézett vizsgálatban nem adagoltak semmilyen kezelést, és a metilénkéket kizárólag a gerincvelő festésére használták, miközben hat hónapon át dokumentálták a felhalmozódó mielin- és axonkárosodást; a két tanulmány tehát nem bizonyítja, hogy a metilénkék segít az emberi SM-ben.