A metilénkék alternatívái mikroszkópiához

Egyszerű bakteriális kenet esetén a kristályibolya helyettesítheti a metilénkéket, ha a cél a sejtek alakjának megfigyelése. Élő sejtek esetében jobb alternatíva lehet a fáziskontraszt, festés nélkül. A választás attól függ, milyen megfigyelést kell elvégeznie.

Tegyük fel, hogy két ember ugyanazt a baktériumtenyészetet vizsgálja. Az egyik pálcika alakú és kerek sejteket szeretne megkülönböztetni. A másik azt szeretné megtudni, hogy egy kezelés elpusztította-e a baktériumokat. Egy olyan festés, amely az első személy számára tiszta képet ad, a másodiknak lehet, hogy egyáltalán nem ad használható választ.

Mielőtt helyettesítőt választana, egészítse ki ezt a mondatot: „A(z) ___ jelenséget kell megfigyelnem ___ mintában, és a sejteknek életben kell / nem kell életben maradniuk.” Ez a mondat határozza meg, milyen feladatot kell a festésnek ellátnia.

Kezdje a mintával és a kérdéssel

Először döntse el, hogy a sejteknek életben kell-e maradniuk, majd határozza meg a megfigyelni kívánt jellemzőt:

A sejteknek életben kell maradniuk: mozgás vagy alak vizsgálatához fontolja meg a festés nélküli fáziskontrasztot vagy DIC-t; a sejtmag DNS-éhez fluoreszcenciával alkalmazott Hoechst 33342 jöhet szóba; a membránintegritáshoz válasszon validált vizsgálatot, például SYTO 9-et propidium-jodiddal.
A sejteknek nem kell életben maradniuk: bakteriális morfológiához fontolja meg a kristályibolyával végzett egyszerű festést vagy a nigrozinos negatív festést; Gram-reakcióhoz használja a teljes Gram-festési módszert; fixált sejtek sejtmag-DNS-éhez fontolja meg a DAPI fluoreszcenciát.

Az alábbi táblázat segítségével összehasonlíthatja az egyes lehetőségek korlátait. Ezek módszerválasztási lehetőségek, nem pedig arra vonatkozó utasítások, hogy egy meglévő protokollban az egyik reagenst egyszerűen másikra cserélje.

Mit kell megfigyelnie	Minta és berendezés	Lehetséges alternatíva	Fő korlát
Baktériumok alakja és elrendeződése	Előkészített bakteriális kenet; világos látóterű mikroszkópia	Egyszerű festés kristályibolyával	Megmutatja a morfológiát; nem állapítja meg a Gram-reakciót vagy az életképességet.
Sejtkontúrok sötét háttér előtt	Bakteriológiai preparátum; világos látóterű mikroszkópia	Nigrozinos negatív festés	Az előkészítés és a készítmény összetétele számít; egy festetlen sejt nem feltétlenül élő.
Gram-reakció	Előkészített bakteriális kenet; világos látóterű mikroszkópia	Teljes Gram-festési módszer	A teljes reagenssorozatot és kontrollokat igényli.
Élő sejtek mozgása vagy változásai	Megfelelő nedves preparátum; fáziskontraszt vagy DIC	Nincs festés	Megfelelő optikát igényel; a kontraszt nem azonosít egy molekulát.
Sejtmag-DNS	Fixált sejtek; fluoreszcencia	DAPI	Kompatibilis gerjesztési és emissziós szűrőket igényel.
Sejtmag-DNS élő sejtekben	Élő sejtek; fluoreszcencia	Hoechst 33342	A sejtbe jutás önmagában nem bizonyítja, hogy a képalkotási körülmények ártalmatlanok.
Bakteriális membránintegritás	Nem fixált baktériumok; fluoreszcencia	SYTO 9 propidium-jodiddal	A membránfestés az életképesség közvetett mérőszáma.

Egyszerű kenetnél körültekintően cserélje le a módszert

A kristályibolya praktikus lehetőség, ha a feladat a baktériumok morfológiájának egyszínű megjelenítése. Az FDA Bacteriological Analytical Manual című kézikönyve két, egyszerű festésre alkalmas kristályibolya-formulát ismertet. Dokumentált formulát és annak előkészítési módszerét használja; önmagában a festék neve nem határoz meg egy használatra kész reagenst.

A kristályibolya a Gram-festésben is szerepel, de ettől a kristályibolyával végzett egyszerű festés még nem lesz Gram-festés. Az ASM Gram-festési protokolljában a differenciáló eredmény a kristályibolya, a jód, az elszíntelenítés és az ellenfestés egymást követő alkalmazásától függ. E lépések kihagyása megváltoztatja, hogy a kép alapján mi állapítható meg. A különbségről lásd az egyszerű festés és a Gram-festés összehasonlítását.

A nigrozin más módon teszi láthatóvá a kontúrokat: elsötétíti a hátteret, miközben a baktériumsejtek viszonylag világosak maradnak. A Merck nigrozinra vonatkozó útmutatójában található egy fontos részlet, amely könnyen kimaradhat egy általános helyettesítőlistából. A megadott használati formula formaldehidet tartalmaz. Ezért a „negatív festés” megnevezésből nem lehet arra következtetni, hogy a módszer kompatibilis az élő sejtekkel, még akkor sem, ha maguk a sejtek festetlennek látszanak. Ellenőrizze a teljes formulát és a minta előkészítését.

Élő mintáknál fontolja meg az optika megváltoztatását

Ha azt szeretné megfigyelni, ahogy a sejtek mozognak vagy osztódnak, egy másik festék bevezetése bonyolíthatja a megfigyelést. Ahogy a Nikon az átlátszó minták kontrasztjáról szóló útmutatójában ismerteti, a fáziskontraszt és a differenciális interferenciakontraszt, vagyis DIC, az optikai tulajdonságok különbségei révén teszi láthatóvá a mintákat. Ezekkel élő, festetlen sejtek is megjeleníthetők, feltéve, hogy a mikroszkóp rendelkezik a szükséges komponensekkel.

Ez a választás megőrzi a festetlen preparátumot, de megváltoztatja a rendelkezésre álló információt. Követhet egy sejthatárt vagy mozgást anélkül, hogy tudná, melyik molekula hozta létre a kontrasztot. Ha a kérdés a molekuláris lokalizációra vonatkozik, válasszon megfelelő jelölési módszert.

A sejtmag DNS-éhez az Invitrogen DAPI- és Hoechst-festékeket összehasonlító anyaga megkülönbözteti a DAPI fixált sejtekkel való általános használatát a sejtmembránon könnyebben átjutó Hoechst 33342-től, amelyet élő sejtek jelölésére részesítenek előnyben. Mindkettő fluoreszcens berendezést igényel. Egyik sem közvetlen helyettesítője egy színes, világos látóterű festésnek.

A festéknek való kitettséget és a megvilágítást kísérleti körülményként kezelje. Ha a sejtek viselkedését méri, hasonlítsa össze a festett és festetlen preparátumokat.

Egy piros sejt nem automatikusan elhalt sejt

A SYTO 9-et és a propidium-jodidot gyakran együtt alkalmazzák a bakteriális membránintegritás értékelésére. A BacLight kézikönyve az ép membránokat zöld, a károsodott membránokat pedig piros festődéssel társítja. Ezt az értelmezést az adott mintára validálni kell.

Egy Rosenberg és munkatársai által végzett 2019-es vizsgálat jól szemlélteti a problémát. Üvegen, foszfátpufferelt sóoldatban növesztett, 24 órás E. coli biofilmekben a sejtek körülbelül 96%-a propidium-jodid-pozitívnak tűnt in situ. A szerzők ugyanakkor úgy becsülték, hogy a begyűjtés után 82% tenyészthető volt. A konfokális felvételeken vörösre festődött anyag alatt zöld belsejű sejtek látszottak, ami arra utalt, hogy az extracelluláris nukleinsavak hozzájárultak a félrevezető jelhez.

Ezek a százalékok a vizsgálat preparátumain végzett különböző méréseket írják le, nem pedig általánosan alkalmazható korrekciós tényezőt. A gyakorlati tanulság az, hogy ellenőrizni kell, mi hozta létre a jelet. Biofilmben egy nukleinsavfesték a károsodott sejtek belsejében lévő anyag mellett a sejteken kívüli anyagot is kimutathatja. Az életképességre vonatkozó következtetéshez a kutatók kiegészítő méréseket, például tenyésztést vagy metabolikus aktivitás vizsgálatát javasolják, miközben megjegyzik, hogy mindegyik módszernek vannak korlátai.

Ellenőrizze, valójában mit tartalmaz az alternatíva

Egy alternatív festési módszer továbbra is tartalmazhat metilénkéket. Ilyen példa a Giemsa: a Merck saját termékét azure-eozin-metilénkék oldatként írja le, amelyet többek között vér- és csontvelőkenetekhez szánnak. Más mintához alkalmazható eltérő módszer lehet, de nem felel meg annak a követelménynek, hogy ne tartalmazzon metilénkéket.

Ha egy vegyület kizárása a kísérlet része, a képek összehasonlítása előtt ellenőrizze a reagens azonosságát és formuláját. A methyl blue, methylene blue és hasonló nevű festékekről szóló útmutató ismerteti az elnevezésbeli különbségeket.

Az eredmény használata előtt ellenőrizze a helyettesítést

Új módszer esetén végezzen kisebb összehasonlítást reprezentatív mintákkal és megfelelő kontrollal. Ahol lehetséges, tartsa összehasonlíthatóan a mikroszkóp beállításait. Jegyezze fel a reagens formuláját, a minta előkészítését, az expozíciót és a képalkotási körülményeket, hogy egy jobb megjelenésű kép okai vizsgálhatók legyenek, ne csak előnyben részesítsék azt.

A sikert az eredeti kérdés alapján ítélje meg. Morfológia esetén értékelje, hogy a sejthatárok és az elrendeződés továbbra is értelmezhetők-e. Sejtmagjelölésnél értékelje a jel helyét és a hátteret. Életképesség esetén egy tetszetős színelkülönülésen túl további bizonyítékot is követeljen meg. A metilénkék-festésről és laboratóriumi alkalmazásairól szóló átfogóbb útmutató bemutatja, hogyan illeszkedik egymáshoz a megfigyelés és a minta előkészítése.

Azt az alternatívát válassza, amely megőrzi az Ön számára szükséges mérési információt. A szín csak az elkészült kép egyik tulajdonsága.