Može li metilensko modrilo zaobići mitohondrijski kompleks III? Zašto se istraživanja ne slažu

Dva su laboratorija ispitala može li metilensko modrilo zaobići blokirani mitohondrijski kompleks III. Jedan je odgovorio ne. Drugi je odgovorio da. Oba su imala podatke.

Prvo istraživanje, na mitohondrijima mišjeg mozga, pokazalo je da bojilo to ne može. Drugo, na mitohondrijima mozga triju vrsta glodavaca, pokazalo je da djelomično može. Treće istraživanje, na mišjoj jetri, često se spominje u istom kontekstu, ali ispitivalo je nešto drugo. Razmotrite ga u odgovarajućem kontekstu i pola nejasnoća nestaje.

Ne može se proglasiti jedan univerzalni mehanizam. Riječ je o trima pokusima s različitim blokatorima, dozama i mjerenim pokazateljima. Najprije proučite uvjete. Zaključci slijede iz njih.

Što ovdje znači zaobilaženje

Elektroni ulaze u lanac preko kompleksa I (iz NADH) ili kompleksa II (iz sukcinata), prolaze kroz kompleks III do citokroma c, a zatim kroz kompleks IV do kisika. Gradijent koji pritom nastaje stanica koristi za stvaranje ATP-a.

Tvrdnja o zaobilaženju znači da metilensko modrilo preuzima elektrone prije mjesta blokade i predaje ih nakon njega. Oksidirano bojilo preuzima elektrone iz NADH ili početnih sastavnica lanca i postaje leukometilensko modrilo, a reducirani oblik predaje ih citokromu c ili vraća u lanac. Ako se elektroni predaju nakon mjesta blokade, disanje i membranski potencijal djelomično se oporavljaju. Ako se predaju na mjestu blokade ili prije njega, nema oporavka.

Jedna pojedinost kompleksa III određuje velik dio ovog neslaganja. Kompleks provodi Q-ciklus s dvama mjestima vezanja inhibitora. Antimicin se veže na mjesto Qi. Miksotiazol se veže na mjesto Qo. Istraživanje koje koristi samo jedan od njih ispitalo je samo polovicu kompleksa.

Prvo istraživanje: nema zaobilaženja u mitohondrijima mišjeg mozga

Gureev i suradnici koristili su mitohondrije moždane kore miševa C57BL/6, izolirane digitoninom, te ih ispitivali pri koncentraciji proteina od 0.1 mg po ml. Supstrati su obuhvaćali tri kombinacije: piruvat i malat, svaki pri 5 mM, sukcinat pri 10 mM s glutamatom pri 2 mM te L-prolin pri 10 mM. Blokatori su bili rotenon pri koncentraciji od 1 mikromolar (kompleks I) i antimicin pri 1 mikrogramu po ml (kompleks III). Doze bojila bile su 0.5, 1 i 2 mikromolar, a 1 mikromolar bila je glavna koncentracija. Metode i zapisi mjerenja nalaze se u kratkom izvješću u časopisu FEBS Letters.

Zaobilaženje kompleksa I funkcioniralo je. Rotenon je smanjio disanje potaknuto ADP-om s oko 121 na oko 2 nmol po minuti po mg, a bojilo pri koncentraciji od 1 mikromolar vratilo ga je na oko 21. Membranski potencijal oporavio se uz piruvat i malat te uz L-prolin.

Zaobilaženje kompleksa III nije funkcioniralo. Antimicin je smanjio disanje na oko 16, a bojilo ga je povećalo samo na oko 20. Membranski potencijal nije se oporavio ni uz jedan supstrat, pri dozama bojila do 5 mikromolar. Podaci o peroksidu upućivali su na isto: samo bojilo povećalo je otpuštanje peroksida s bazalne brzine od približno 76 pmol po minuti po mg na otprilike 1170, 1460 i 1945 pri trima dozama, no antimicin je smanjio taj signal izazvan bojilom za približno 25, 88 i 96 posto, redom. Kad bi reducirano bojilo reagiralo izravno s kisikom, blokiranje kompleksa III ne bi trebalo potisnuti signal. Autori su zaključili da se reducirano bojilo oksidira na mjestu Qo kompleksa III, prije mjesta blokade antimicinom. Kratka petlja, opisana riječima: donori predaju elektrone bojilu, bojilo ih predaje mjestu Qo, a dalje slijedi uobičajeni put. Rotenon se zaobilazi. Antimicin ne.

Drugo istraživanje: djelomično zaobilaženje u triju vrsta, na oba mjesta vezanja inhibitora

Svab i suradnici proširili su eksperimentalni nacrt. Mitohondrije mozga miševa, štakora i zamoraca izolirali su Percollom te ih ispitivali pri istoj koncentraciji od 0.1 mg po ml, uz piruvat i malat ili glutamat i malat, svaki pri 5 mM. Koristili su dva blokatora kompleksa III: antimicin A pri 0.3 mikromolar i miksotiazol pri 1 mikromolar. Koncentracija bojila bila je 2 mikromolar u većini mjerenja, a 0.5 u pokusima s citokromom c. Sve tri vrste, ispitane usklađenim protokolima, obuhvaćene su radom u otvorenom pristupu.

Obje su blokade djelomično zaobiđene, u svih triju vrsta. U mišjim mitohondrijima antimicin je potisnuo disanje, a bojilo ga je povećalo za oko 60 posto, s otprilike 37 na 59 nmol po minuti po mg. Miksotiazol ga je potisnuo za 88 posto, na oko 4.5, a bojilo ga je povećalo peterostruko, na oko 23. Membranski potencijal djelomično se ponovno uspostavio uz oba inhibitora, a mjeren je dvama bojilima (safraninom O i ratiometrijskim TMRM-om) kako bi se isključili optički artefakti.

U ovom je radu izravno ispitana i predaja elektrona, što u prvom istraživanju nije učinjeno. Egzogeni acetilirani citokrom c pri 25 mikromolar nije se reducirao djelovanjem energiziranih mitohondrija, ni s inhibitorima ni bez njih, ali dodavanje bojila potaknulo je redukciju u oba slučaja. U puferu bez stanica NADH s bojilom reducirao je citokrom c brzinom razmjernom količini NADH. Dulji skok, opisan riječima: redukcijski ekvivalenti prelaze na bojilo, bojilo ih izravno predaje citokromu c, a kompleks IV kisiku. Taj put u cijelosti preskače kompleks III, pa se oba blokatora mogu zaobići.

Dva dodatna pokazatelja podupiru to tumačenje. Fluorescencija NAD(P)H smanjila se nakon dodavanja bojila mitohondrijima tretiranima miksotiazolom, što znači da su redukcijski ekvivalenti otjecali novim putem. A apsorbancija bojila pri 660 nm pratila je svako uzastopno dodavanje, dok su supernatanti nakon centrifugiranja pokazali da se oksidirano bojilo nakuplja u energiziranim mitohondrijima više od stostruko, a zatim ih napušta kada potencijal kolabira. Uklapa se i bilanca protona: preskakanje koraka pumpanja ostavlja otprilike 2 protona po paru elektrona umjesto 10, pa je brža potrošnja kisika uz samo djelomičnu repolarizaciju upravo ono što se očekuje pri stvarnom zaobilaženju, a ne dokaz protiv njega.

Isti je pripravak dao rezultate koji se lako pogrešno protumače pri površnom čitanju. Uz inhibitor i bojilo ADP je smanjio disanje umjesto da ga poveća, a blokada transporta potaknula ga je umjesto da ga uspori, dok se membranski potencijal i dalje mijenjao u uobičajenim smjerovima. Sama potrošnja kisika u ovom sustavu može dovesti do pogrešnih zaključaka.

Treće istraživanje: istraživanje jetre koje je ispitivalo komplekse I i II, a ne III

Lee i Boelsterli koristili su mitohondrije mišje jetre i hepatocite u kulturi oštećene efavirenzom (kompleks I, IC50 približno 30 mikromolar) i hidrazinom, metabolitom izoniazida (kompleks II, IC50 približno 30 mikromolar). Bojilo pri približno 30 mikromolar obnovilo je oksidaciju NADH, membranski potencijal i ATP, uz smanjenje oksidansa i nekrotične smrti. Rad u časopisu Redox Biology prikazuje to kao prijenos elektrona bojilom kojim se zaobilaze oštećeni kompleksi I i II.

Taj je rezultat potvrđen kontekst za raniji dio lanca i ne govori ništa o kompleksu III jer on u tom istraživanju nije bio blokiran. Ne može potvrditi ni opovrgnuti nijedno istraživanje na mozgu.

Matrica uvjeta

Četiri razloga zbog kojih oba istraživanja kompleksa III mogu biti točna za vlastite eksperimentalne uvjete

1. Blokatori nisu predstavljali istu intervenciju. Sam antimicin pri 1 mikrogramu po ml nasuprot antimicinu pri 0.3 mikromolar uz zaseban blokator mjesta Qo. Put kojim bojilo dovodi elektrone na mjesto Qo ne uspijeva upravo ondje gdje uspijeva izravni put do citokroma c. Jedno mjesto ne može predstavljati oba.

2. Doza bojila i vremenski tijek razlikovali su se. Glavne koncentracije bile su 1 nasuprot 2 mikromolar, za tvar koja sudjeluje u redoks-ciklusu i čiji unos i izravna redukcija citokroma c ovise o koncentraciji i vremenu. Male razlike u dozi uz različito vrijeme mjerenja mogu otkriti različite ogranke iste mreže.

3. Pripravci su se razlikovali. Izolacija digitoninom nasuprot izolaciji u gradijentu Percolla odabire populacije mitohondrija koje se preklapaju, ali nisu istovjetne. Koncentracija proteina bila je jednaka, 0.1 mg po ml, pa ta varijabla otpada, ali podpopulacija i očuvanost ne. A vrsta je isključena kao uzrok razlike: druga je skupina svoj fenotip reproducirala i u miša.

4. Stanje supstrata određuje što bojilo može učiniti. Tri skupine supstratnih uvjeta nasuprot parovima povezanima s NADH. Opskrba NADH i membranski potencijal zajedno određuju koliko se brzo bojilo reducira i kako se raspodjeljuje, a put kojemu treba reducirano bojilo uz oksidirani citokrom c ovisi o tom izboru.

Kako čitati sljedeću tvrdnju o zaobilaženju

Pitajte koji je kompleks bio blokiran, kojim inhibitorom, na kojem mjestu i pri kojoj dozi. Pitajte kolika je bila koncentracija bojila i kada je obavljeno mjerenje. Pitajte koje su tkivo, vrsta, način izolacije, koncentracija proteina i supstrat korišteni. I pitajte slažu li se potencijal, disanje, redoks-stanje i izravno mjerenje predaje elektrona, jer je sama potrošnja kisika ovdje više puta upućivala na pogrešan zaključak.

Usko formuliran sažetak ostaje valjan. Zaobilaženje kompleksa I bojilom nije sporno. Za kompleks III mišji mitohondriji uz antimicin pri 1 mikrogramu po ml i bojilo pri 1 mikromolar ne pokazuju funkcionalno zaobilaženje, dok tri vrste uz antimicin pri 0.3 mikromolar ili miksotiazol pri 1 mikromolar i bojilo pri 2 mikromolar pokazuju djelomično zaobilaženje uz izravan prijenos s bojila na citokrom c. Te tvrdnje mogu istodobno vrijediti. Sve šire od toga jest ekstrapolacija.

Povezano štivo smješta spornu tvrdnju u okvir nesporne kemije: kako metilensko modrilo prenosi elektrone objašnjava prijenos, pokusi zaobilaženja kompleksa I potvrđeni slučaj u ranijem dijelu lanca, mjerenja membranskog potencijala i njihovi artefakti zašto su bila potrebna dva bojila, a laboratorijsko rukovanje tvarima koje sudjeluju u redoks-ciklusima zamke vezane uz doziranje i vrijeme.