Metilensko modrilo, tau i amiloid: zašto se mehanizmi uklanjanja proteina razlikuju

Pitate li što metilensko modrilo čini proteinima povezanima s Alzheimerovom bolešću, čut ćete jedan samouvjeren odgovor ondje gdje biste trebali čuti tri odgovora s jasno navedenim ograničenjima. U epruveti ometa međusobno povezivanje molekula proteina tau. U jednom mišjem modelu snižava razinu topljivog amiloida, a tau ostavlja nepromijenjenim. U drugom smanjuje aktivnost enzima koji uopće omogućuje stvaranje amiloida. Svaki je od tih nalaza stvaran. Nijedan ne daje potpunu sliku i ne pojavljuju se svi istodobno u istoj životinji. Ovaj članak razdvaja ta tri nalaza kako se rezultat jednog pokusa više ne bi navodio kao dokaz za drugi.

Čitatelji koji žele širu sliku o tome kako metilensko modrilo djeluje unutar stanica trebali bi početi ondje. Čitatelji koji žele znati je li išta od toga pomoglo pacijentima trebali bi pročitati pregled kliničkih istraživanja Alzheimerove bolesti, kojemu pripadaju ishodi ispitivanja na ljudima. Ovaj članak ne ponavlja taj pregled.

Nalaz o proteinu tau pripada testovima agregacije

Najstarija od tih triju priča potječe iz istraživanja proteina tau u sustavima bez stanica; taj protein tvori neurofibrilarne spletove. U testu vezanja tau-tau fragmenti proteina tau udružuju se u uparene spiralne filamente, a fenotiazinska bojila, uključujući metilensko modrilo, blokiraju to udruživanje pri niskim mikromolarnim koncentracijama. Kasnija biokemijska istraživanja dala su kemijsko objašnjenje: bojilo oksidira cisteinske ostatke u proteinu tau, što stabilizira monomerni oblik i potiskuje nastanak fibrila koji bi inače rasli. Objavljene koncentracije koje inhibiraju agregaciju proteina tau kreću se otprilike od jednoznamenkastih do niskih desetaka mikromola, što je raspon važan za sve što slijedi.

Obratite pozornost na vrstu te tvrdnje. Ona ne govori ništa o stvaranju proteina tau, njegovoj fosforilaciji u živom mozgu ili njegovu uklanjanju. Govori da u definiranim uvjetima u epruveti oksidirano bojilo sprječava slaganje molekula proteina tau. To je precizan, usko određen i koristan rezultat. Problem nastaje kada se proširi u opću tvrdnju da metilensko modrilo uklanja patološke promjene povezane s proteinom tau, jer podaci iz istraživanja na životinjama ne podupiru tu verziju.

Nalaz o proteasomu pripada miševima 3xTg-AD i pokazao je razliku između amiloida i proteina tau

Pokus koji najjasnije pokazuje razilaženje ishoda jest 16-tjedno istraživanje prehrambene primjene u miševa koji nose tri mutacije povezane s Alzheimerovom bolešću. Životinje su od dobi od šest mjeseci jele hranu koja je sadržavala metilensko modrilo, a istraživači su istodobno mjerili tri stvari: proteasom, razine amiloida i tau.

Aktivnost proteasoma promijenila se. Aktivnost nalik kimotripsinu porasla je za otprilike četvrtinu, a aktivnost nalik tripsinu za otprilike polovicu, dok se treća katalitička aktivnost nije značajno promijenila. Razine topljivog amiloida-beta 40 i 42 pale su, svaka za otprilike četvrtinu. Autori su to protumačili kao pojačano uklanjanje, a ne smanjeno stvaranje, jer se prekursorski protein i fragmenti nastali njegovom obradom nisu promijenili, a učenje i pamćenje poboljšali su se u provjernom testu u vodenom labirintu.

Zatim slijede razilaženja. Netopljivi amiloid nije se promijenio. Bojenje plakova nije se promijenilo. Ukupni ljudski tau i fosforilirani tau na treoninu 181 nisu se promijenili, kao ni nepravilna lokalizacija proteina tau. Nisu se promijenili ni mitohondrijski pokazatelji: nije bilo značajnog učinka na aktivnost citokrom-c oksidaze, na količinu proteina te oksidaze ni na ATP. Dakle, u ovom modelu, uz ovaj režim primjene, metilensko modrilo povećalo je dvije od triju aktivnosti proteasoma, snizilo topljivi amiloid, poboljšalo jednu mjeru ponašanja te ostavilo nepromijenjenima ishode vezane uz tau, netopljivi amiloid i ispitane mitohondrijske pokazatelje.

Jedno ograničenje izoštrava zaključak umjesto da ga oslabljuje. Ti miševi u ispitanoj dobi još nisu razvili agregate proteina tau, pa pokus ne može pokazati da metilensko modrilo ne djeluje na spletove proteina tau. Pokazuje da topljivi amiloid može pasti dok se mjereni ishodi vezani uz tau ne mijenjaju, što je upravo vrsta rezultata u kojem se jedan protein mijenja, a drugi ne, kakva je potrebna za ovu temu. Ako ste ovamo došli vjerujući da aktivacija proteasoma metilenskim modrilom istodobno uklanja oba karakteristična proteina, ovo istraživanje ispravlja tu predodžbu.

Nalaz o stvaranju amiloida pripada starim miševima PSAPP i proturječi prethodnom mehanizmu

Druga skupina, drugi model i suprotno objašnjenje ranijeg koraka u procesu. U tromjesečnom istraživanju primjene sondom u 15-mjesečnih miševa PSAPP dnevna oralna doza od 3 mg/kg smanjila je opterećenje plakovima u različitim područjima mozga za otprilike trećinu do polovicu i snizila nekoliko frakcija amiloida, uključujući oligomere mjerene namjenskim testom. No ovdje je predloženi mehanizam bio smanjeno stvaranje, a ne brže uklanjanje: razina proteina BACE1 u mozgu pala je, razina njegova produkta C99 pala je, a glasnička RNA nije, što upućuje na učinak na razini proteina, a ne na smanjenu ekspresiju gena.

Istraživanja na stanicama dodatno su potkrijepila to tumačenje. U testu bez stanica s rekombinantnim enzimom metilensko modrilo izravno je inhibiralo BACE1, a u stanicama jajnika hrčka koje eksprimiraju ljudski prekursorski protein amiloida razine izlučenog amiloida 40 i 42 pale su već pri koncentracijama od 1.56 mikromola, dok je sam prekursor ostao nepromijenjen. Usporedite to s prethodnim istraživanjem, u kojem se fragmenti nastali obradom prekursora nisu promijenili, a učinak je pripisan uklanjanju. Oba nalaza ne mogu opisivati isti univerzalni mehanizam jer se razlikuju modeli, dobi, doze, putovi primjene i trajanja. Upravo je to bit. Učinci metilenskog modrila na amiloid u jednom eksperimentalnom sustavu ostvaruju se preko stvaranja, a u drugom preko uklanjanja; navođenje bilo kojeg od tih nalaza bez pripadajućih uvjeta dovodi u zabludu.

Jedna kemija, više meta: poveznica kroz oksidaciju cisteina

Treći smjer istraživanja objašnjava kako se ista redoks-kemija može pojaviti u nepovezanim pričama o proteinima. U biokemijskom istraživanju inhibicije kaspaza metilensko modrilo inaktiviralo je kaspazu-6 oksidacijom njezina katalitičkog cisteina u sulfensku kiselinu, što je potvrđeno masenom spektrometrijom, uz koncentraciju za polovicu maksimalnog učinka blizu 10.6 mikromola. Kaspaza-3 inhibirana je pri sličnoj koncentraciji. Autori su to izričito povezali s literaturom o proteinu tau: ista kemija oksidacije cisteina, predložena kao način održavanja proteina tau u monomernom obliku, može onesposobiti cisteinsku proteazu, a učinkovite koncentracije preklapaju se.

To je elegantno, ali i upozoravajuće. Redoks-aktivna molekula koja oksidira izložene cisteine imat će više od jedne mete pri bilo kojoj koncentraciji na kojoj djeluje. Priča o razgradnji agregata proteina tau, priča o kaspazama i možda druge priče dijele istu kemijsku radnju, ali različite objekte na koje ona djeluje. Ta zajednička radnja ne čini nalaze međusobno zamjenjivima. Znači da doza i kontekst određuju koja je meta važna te da dugotrajno doziranje usmjereno na jedan proces ovisan o cisteinu može zahvatiti i druge, na što su autori istraživanja kaspaza izravno upozorili. Povezana pitanja o tome kako redoks-kemija metilenskog modrila odabire svoje mete, što aktivacija proteasoma znači za druge agregirane proteine i mijenja li dugotrajno doziranje profil meta zaslužuju zasebnu obradu.

Mehanizam prema ishodu: koji nalaz pripada kojem modelu

Pročitajte tablicu redak po redak i pouka je jasna. Nijedan redak ne pokazuje promjenu u svakom stupcu. Najjači rezultat o stvaranju amiloida dolazi iz istraživanja u kojem proteasom uopće nije ispitan. Najjači rezultat o proteasomu dolazi iz istraživanja u kojem se obrada prekursora nije nimalo promijenila. Nalaz o proteinu tau uglavnom pripada epruvetama i kemiji koju dijeli s enzimima koji nisu namjeravane mete. Svatko tko te stupce spoji u jednu tvrdnju, da metilensko modrilo uklanja patološke proteine kao skupinu, piše pregled pokusa koji nikada nije proveden.

Takva dosljednost vrijedi i za pacijente. Dovode li ti mehanizmi zajedno do kliničke koristi zasebno je pitanje sa svojim ispitivanjima i zaključcima, a odgovor na njega nalazi se u kliničkim dokazima za Alzheimerovu bolest, a ne ovdje.