Metilensko modrilo za ozljedu mozga: razumijevanje pretkliničkih dokaza

Udarac u glavu, začepljena arterija i spora neurodegenerativna bolest mogu završiti istom tegobom: mozak više nema energije za obavljanje svojih funkcija. Taj zajednički ishod razlog je zbog kojeg se isti spoj neprestano pojavljuje u literaturi o sva tri područja. No zajednički ishod ne znači i zajednički koncept. Primjena prije ozljede, primjena u satu nakon nje i procjena učinka mjesecima poslije ispituju različite ideje, čak i kada se u štrcaljki nalazi ista plava tekućina.

Ovaj članak prati dio te literature koji se bavi ozljedama. Razmatra što primjena metilenskog modrila za ozljedu mozga znači u pokusima na životinjama, razdvaja traumatsku ozljedu od moždanog udara i kronične neurodegeneracije te pokazuje zašto vrijeme primjene doze objašnjava većinu razlika među istraživanjima.

Tri ozljede, jedan energetski zastoj

Mehanizam koji povezuje te modele nalazi se u mitohondrijima. U normalnim uvjetima elektroni prolaze kroz lanac prijenosa elektrona kako bi se proizveo ATP, a zdrav lanac drži reaktivne kisikove vrste pod kontrolom. Nakon ozljede dijelovi lanca posustaju, proizvodnja ATP-a opada, a stvaranje slobodnih radikala raste. Pregledni rad iz 2018. u časopisu Molecular Neurobiology opisuje metilensko modrilo kao alternativni prijenosnik elektrona: prihvaća elektrone od NADH-a i predaje ih citokromu c, čime povećava aktivnost kompleksa IV i obnavlja sintezu ATP-a čak i kada je početni dio lanca oštećen.

Navedene su brojke konkretne. U staničnim pripravcima i pripravcima tkivnih rezova aktivnost kompleksa IV porasla je za 30 do 100 posto, uz usporedan porast potrošnje kisika, što upućuje na to da su dodatni elektroni obavljali koristan rad umjesto da su curili iz lanca kao radikali. U modelu moždanog udara na štakorima proizvodnja ATP-a u zahvaćenom području bila je oko 30 posto viša 24 sata nakon primjene nego u životinja koje nisu primile spoj. Pregledni rad iz 2022. u časopisu Biochemistry (Moscow) dodaje daljnje posljedice: manje oksidativnog stresa, manje neuroinflamacije, manje apoptoze te učinke na monoaminooksidazu, sintazu dušikova oksida, mitohondrijsku biogenezu, autofagiju i agregaciju pogrešno smotanih proteina.

Koncept je, dakle, jednostavan. Ozljeda blokira uobičajeni put elektrona, a metilensko modrilo nudi zaobilazni put. Sve što slijedi ovisi o tome o kojoj je ozljedi riječ, kada se spoj primjenjuje i kako se učinak mjeri.

Traumatska ozljeda nije moždani udar

U modelu traumatske ozljede mozga sila djeluje odjednom. Primarno oštećenje mehaničke je prirode: tkivo se razdire, krvne žile pucaju, a krvno-moždana barijera otvara se u roku od nekoliko minuta. Ono na što bi metilensko modrilo moglo djelovati jest sekundarni val koji slijedi tijekom sati i dana, dok mitohondriji u preživjelom tkivu otkazuju, upala se širi, a edem raste. Ishodi u tim istraživanjima odražavaju taj slijed: volumen lezije, sadržaj vode u mozgu, preživljenje neurona blizu mjesta udarca te kasnije ponašanje, poput motoričkog oporavka ili učenja u labirintu.

U modelu moždanog udara ili globalne ishemije štetni događaj ima posve drukčiji tijek. Protok krvi prestaje, energetski zastoj slijedi u roku od nekoliko minuta, a obnova protoka donosi vlastito reperfuzijsko oštećenje. Ovdje se primjena doze usklađuje s događajem u krvnoj žili, često unutar nekoliko minuta od okluzije ili reperfuzije, a ishodi kvantificiraju akutnu sudbinu tkiva tijekom nekoliko sati do jednog ili dva dana: veličinu infarkta, protok krvi i rani funkcionalni oporavak. Jedan je obrazac u literaturi o moždanom udaru primjena prije događaja, pri čemu životinje dobivaju dozu prije okluzije krvne žile. Time se ispituje prevencija na način koji nijedan pokus s ozljedom glave ne može etički ponoviti na ljudima.

Rezultati istraživanja moždanog udara najčvršći su u literaturi o ozljedama, a uključuju i najjasniji nalaz izostanka učinka. Štakori koji su primili metilensko modrilo pri reperfuziji nakon jednosatne okluzije srednje moždane arterije imali su 2. dana infarkte manje za 30 posto, uz očuvan veći dio ugrožene jezgre i penumbre (Shen, 2013). Istraživanje trajne okluzije pokazalo je sporije napredovanje ugroženog tkiva prema infarktu, ali bez smanjenja konačnog volumena infarkta nakon 24 sata pri bilo kojoj od dviju ispitanih doza (Rodriguez, 2014). Treće istraživanje okluzije smanjilo je veličinu infarkta približno napola pri srednjoj dozi i izravno dokumentiralo mitohondrijsku ultrastrukturu i mitofagiju u ishemičnom mozgu, uz neočekivan detalj da je izmjerena apoptoza rasla dok je nekroza opadala (Di, 2015). U globalnoj ishemiji kontinuirana infuzija niske doze obnovila je aktivnost citokrom c oksidaze, razine ATP-a i potencijal mitohondrijske membrane u osjetljivom području CA1 hipokampusa, očuvala te neurone i zaštitila prostorno pamćenje (Lu, 2016). Vrijedi se zadržati na tom mjerenju u području CA1: riječ je o izravnim podacima o ATP-u i respiracijskom lancu unutar ozlijeđenog mozga, o kojima se u literaturi o TBI-ju uglavnom zaključuje posredno, umjesto da ih se mjeri.

Kronična neurodegeneracija razlikuje se od obaju navedenih stanja. U modelima Alzheimerove, Parkinsonove i Huntingtonove bolesti životinje primaju doze tjednima ili mjesecima, a mjeri se agregacija proteina, obrada dopamina ili postupno kognitivno propadanje. Ti ishodi gotovo nemaju ništa zajedničko s lezijom izmjerenom nekoliko dana nakon udarca. Čitatelji koji prenose rezultat iz jedne kategorije u drugu prenose nalaz preko granice koju pokusi nikada nisu prešli. Naš vodič kroz literaturu o neurodegeneraciji zadržava ta dugotrajna istraživanja u njihovu vlastitom okviru, a usporedba s dokazima koji se odnose samo na moždani udar detaljno razdvaja pokuse sa začepljenjem krvnih žila od pokusa s udarcem.

Što su modeli TBI-ja zapravo ispitivali

Nije objavljeno nijedno ispitivanje metilenskog modrila za traumatsku ozljedu mozga na ljudima. Svi podaci o TBI-ju potječu iz istraživanja na životinjama, uglavnom štakorima i miševima, a okupljeni su oko malog broja pokusa koje vrijedi navesti jer se njihovi detalji razlikuju na načine koje sažeci brišu.

U najranijem istraživanju kontroliranog kortikalnog udarca štakori su primili 1 mg/kg intravenski jedan sat nakon blagog udarca, zatim 0.5 mg/kg nakon tri sata (Watts, 2014). Volumen lezije izmjeren MRI-jem ostao je manji u životinja koje su primile spoj tijekom dva tjedna praćenja. Broj pogrešnih koraka na testu hodanja značajno se smanjio 1., 2. i 7. dana, ali ne i 14. dana. Mikroskopski pregled 14. dana pokazao je 270 naspram 368 degenerirajućih neurona po vidnom polju u ozlijeđenoj kori te 41 naspram 73 neurona s abnormalnim Nisslovim bojenjem. Drugim riječima, zabilježena je rana zaštita, ali prednost u ponašanju slabila je do drugog tjedna.

U pokusu s difuznom ozljedom miševa korištena je perkusija tekućinom po središnjoj liniji i jednokratna intravenska doza od 2 mg/kg unutar pola sata (Fenn, 2015). Životinje koje su primile spoj pokazale su slabiju ekspresiju upalnih gena, manje upalno aktiviranih mikroglijskih stanica, manje izražen edem i odsutnost ponašanja nalik depresiji 7. dana. Jednako su važni nalazi izostanka učinka: sama ozljeda samo je umjereno povećala sadržaj vode u mozgu, a metilensko modrilo nije spriječilo gubitak tjelesne mase ni manjak motoričke koordinacije. Protuupalno djelovanje nije isto što i potpuna zaštita.

Dva istraživanja na miševima koristila su isti raspored, 1 mg/kg nakon jednog sata, 0.5 mg/kg nakon šest sati, zatim svakodnevnu primjenu tijekom tri dana, te proširila uvid u mehanizam. U modelu kortikalnog udarca primjena je smanjila volumen lezije nakon 24 sata, 72 sata i 14. dana, uz očuvanje neurona i povećanje biljega autofagije (Zhao, 2016). U modelu perkusije tekućinom smanjila je apoptozu neurona, smanjila propusnost krvno-moždane barijere i poboljšala neurološke rezultate tijekom dva tjedna (Shen, 2019). Ipak, sadržaj vode u mozgu nije se razlikovao nakon 72 sata u istraživanju Zhao, a izvedba na rotarodu nije se razlikovala 1. i 3. dana u istraživanju Shen. Ishodi vezani uz leziju i preživljenje stanica mijenjali su se; oticanje i rani motorički ishodi nisu uvijek pratili te promjene.

Kad je riječ o vremenu primjene, izdvaja se pokus s odgođenom primjenom (Watts, 2016). U istom modelu udarca prva doza odgođena je do 24 sata nakon ozljede. Do 2. dana skupina s odgođenom primjenom pokazala je smanjenje lezije usporedivo s onim u životinja koje su primile spoj u prvim satima, a smanjenje se održalo 7. i 14. dana. Signal u ponašanju bio je slabiji: poboljšanje broja pogrešnih koraka u skupini s odgođenom primjenom bilo je statistički neznačajan trend. Jedan laboratorij, jedan model, jedan vremenski prozor od 24 sata. To je stvaran dokaz da se vremenski prozor proteže i nakon prvih sati, ali ujedno je i cjelokupan dokaz za tu tvrdnju. Treba uočiti zamku u riječi odgođeno kada se pojavljuje drugdje: ruska serija istraživanja s naslovima o odgođenoj neuroprotekciji primjenjivala je dozu nakon 30 minuta, a riječ odgođeno odnosila se na dugotrajne ishode, ne na kasni početak primjene.

Manje istraživanje žarišne ozljede na štakorima upotpunjuje sliku vremena primjene iz suprotnog smjera: i primjena neposredno prije ozljede i primjena 30 minuta nakon nje smanjile su poremećaj funkcije udova (Stelmashook, 2019). Primjena prije ozljede djeluje u laboratoriju upravo zato što laboratorij određuje kada će se ozljeda dogoditi.

Ovdje je važna preciznost u doziranju. Pregledni radovi opisuju niske doze kao poticajne za mitohondrijsko disanje, a visoke kao inhibicijske, što je isti dvofazni obrazac koji se opaža u farmakologiji metilenskog modrila. Zato se rezultati ne mogu tumačiti kao više modrila, bolji oporavak. Svako istraživanje ispituje jednu točku na krivulji. Objašnjenje odnosa doze i odgovora prati tu krivulju kroz različite modele, a sigurnosni profil i nuspojave obrađuju što se događa pri višim dozama.

Pogledajte tablicu po redovima: isti spoj, tri različita vremenska tijeka. Prevencija pripada srednjem redu, neposredno liječenje prvim dvama, a odgođeni ishodi prvom i trećem.

Prevencija, neposredno liječenje, odgođeni ishodi

Tvrdnju o prevenciji najlakše je pogrešno razumjeti. U modelima ishemije životinje koje primaju dozu prije okluzije krvne žile prolaze bolje, a taj se rezultat ponekad navodi kao da metilensko modrilo štiti svaki mozak od svakog budućeg štetnog događaja. On ne pokazuje ništa takvo. Pokazuje da mitohondriji pripremljeni alternativnim putem elektrona bolje podnose unaprijed planiran prekid protoka krvi. Nitko ne planira ozljedu glave.

Dokazi o TBI-ju uglavnom se odnose na neposredno liječenje. Primjena u satima nakon udarca cilja kaskadu sekundarne ozljede dok se ona još odvija: energetski zastoj, oksidativni stres, upalu i oticanje. Poboljšanja ishoda vezanih uz leziju i edem u tom razdoblju stvarni su učinci liječenja, ali riječ je o liječenju procesa, ne o poništavanju razdiranja tkiva.

Odgođeni ishodi treći su koncept. Ponašanje mjereno tjednima nakon ozljede ili obrada proteina mjerena nakon više mjeseci u degenerativnom modelu odgovaraju na pitanje je li rana zaštita potrajala ili jesu li spori procesi promijenili tijek. Manja lezija nakon 24 sata, statistički neznačajan trend u ponašanju nakon prve doze odgođene za 24 sata i poboljšanje izvedbe u labirintu nakon više mjeseci kronične primjene tri su različite tvrdnje s tri različita zahtjeva za dokazivanjem, a zasad je samo prva više puta dosegnula potreban prag dokaza.

Što ovi dokazi ne mogu pokazati

Svaki gore navedeni rezultat ima isto ograničenje. Mitohondriji glodavaca odgovaraju na metilensko modrilo na načine koji bi mogli biti zajednički i ljudskim mitohondrijima, ali štakor koji primi intravensku dozu nekoliko minuta nakon udarca kontrolirane jačine nije isto što i osoba koja dolazi u hitnu službu nekoliko sati nakon pada. Anestezija, kontrolirana težina ozljede, mlade zdrave životinje i kratko praćenje ograničavaju prenosivost nalaza. Uopće ne postoji istraživanje metilenskog modrila u ozljedama uzrokovanima eksplozijom, pa je vrsta ozljede najvažnija čitateljima iz vojnog okruženja upravo ona s najmanje dokaza.

Ovdje se također ne nudi preračunavanje doze za ljude. U istraživanjima na životinjama koriste se intravenski i intraperitonealni put primjene, uz doze odabrane radi kontrole pokusa, a ne oralne kapi koje se prodaju u maloprodaji. Ništa u tim istraživanjima ne određuje režim primjene za ljude, a ništa ovdje ne ispituje metilensko modrilo uz standardno zbrinjavanje ozljede glave.

Pošten sažetak stoga stane u jedan odlomak. U glodavaca metilensko modrilo primijenjeno približno u vrijeme traumatske ili ishemijske ozljede mozga očuvava proizvodnju energije u mitohondrijima, a nakon tog očuvanja slijede manje lezije i bolji rezultati oporavka. Jedno istraživanje udarca zadržalo je dio učinka na leziju uz prvu dozu odgođenu za 24 sata. Događa li se išta od toga u ozlijeđenom ljudskom mozgu nije ispitano, a literatura o TBI-ju i moždanom udaru ispituje različita vremena primjene prema različitim ishodima. Svatko tko na temelju ovih dokaza prodaje sigurnost dodaje sastojak koji pokusi nikada nisu sadržavali.