Metilensko modrilo i multipla skleroza: što su ispitivala istraživanja na životinjama

Pretražite li metilensko modrilo za MS, naići ćete na radove koji naizgled odgovaraju na isto pitanje. No ne odgovaraju. U jednom su radu bolesni miševi primali metilensko modrilo kao terapiju. U drugom nijedna životinja nije njime liječena. Metilensko modrilo upotrijebljeno je kao plava boja na tankim presjecima leđne moždine kako bi patolog mogao vidjeti mijelin pod mikroskopom.

To je temeljna ideja cijelog članka. Ta boja ima dvije uloge u biologiji koje nemaju ništa zajedničko osim bočice. Kao kandidat za lijek daje se živoj životinji, a pitanje je mijenja li se bolest. Kao boja nanosi se na mrtvo, fiksirano tkivo nakon pokusa, a pitanje je kako je tkivo izgledalo. Previdite li tu razliku, odjeljak o metodama patološke analize čitat ćete kao da prikazuje rezultat liječenja.

Što je EAE, jednostavnim riječima

Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, obično skraćen kao EAE, standardni je životinjski model nekih aspekata multiple skleroze. Istraživač imunizira osjetljivog miša fragmentom mijelinskog proteina uz snažan adjuvans. Imunosni sustav zatim napada vlastiti središnji živčani sustav životinje. Miš razvija uzlaznu slabost koju je lako ocijeniti na ljestvici od 0 do 5, od mlohavog repa do paralize stražnjih udova.

Ta jednostavnost ocjenjivanja objašnjava zašto je EAE popularan, ali i zašto može zavarati. MS u ljudi nastaje spontano, uključuje širi i manje jasno određen skup meta te uzrokuje vidne, osjetne, kognitivne, cerebelarne i motoričke simptome, uz relapsni ili progresivni tijek. EAE u kontroliranim uvjetima reproducira odabrane mehanizme kao što su upala, demijelinizacija i oštećenje aksona. Ne reproducira MS u malom. Čitatelji koji žele opći okvir mogu proučiti kako se smatra da metilensko modrilo djeluje na staničnoj razini prije nego što procijene bilo koju pojedinačnu tvrdnju o bolesti.

Dva rada u nastavku upotrebljavala su i različite antigene za EAE, što je važno. U istraživanju liječenja bolest je izazvana s MOG35-55, kratkim peptidom mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina. U patološkom istraživanju bolest je izazvana s MP4, fuzijskim proteinom sastavljenim od segmenata mijelinskog bazičnog proteina i proteolipidnog proteina. Odabir soja i antigena mijenja mjesta pojave lezija i način odvijanja upale, pa ta dva istraživanja nisu dva ponavljanja istog pokusa.

Pregled: od modela preko pitanja do ograničenja

Držite ovu tablicu otvorenom. Ona je osnovni pregled za ovaj članak. Svaki redak navodi na koje kliničko pitanje model može odgovoriti, što je doista mjereno i gdje prestaje mogućnost prijenosa rezultata na ljude.

Svatko tko provjerava sljedeći naslov može upotrijebiti iste stupce uz pomoć članka o tome kako čitati pretklinička istraživanja: provjerite vrstu i antigen, ulogu spoja, ishode te prikazuje li rezultat tijek bolesti ili stanje tkiva u određenom trenutku.

Rezultat liječenja: što je primjena promijenila

U istraživanju liječenja iz 2016. objavljenom u časopisu Journal of Neuroimmunology upotrijebljene su ženke miševa C57BL/6, stare oko 8 do 10 tjedana, imunizirane s 250 mikrograma MOG35-55 po mišu. Nakon izazivanja bolesti životinje s EAE-om nasumično su raspoređene u skupinu koja je primala metilensko modrilo ili u neliječenu skupinu s EAE-om, a kliničke ocjene praćene su do otprilike 30. dana.

Kliničke ocjene bile su značajno niže u liječenih miševa nego u kontrolnih miševa s EAE-om od 15. do 30. dana, uz P manji od 0.01. Analiza leđne moždine upućivala je u istom smjeru: u liječenih životinja zabilježeno je manje upalne infiltracije, manje demijelinizacije i manji gubitak aksona.

Posebnost istraživanja bio je skup pokazatelja signalizacije. Liječenje je povećalo aktivaciju AMPK i ekspresiju SIRT1 te potisnulo aktivaciju NF-kB, središnjeg regulatora upale. U području adaptivne imunosti smanjilo je odgovor Th17 i ojačalo odgovor Treg. Predloženi slijed stoga ide od metilenskog modrila preko AMPK i SIRT1 do slabije signalizacije NF-kB, zatim do pomaka s upalnog odgovora Th17 prema regulatornom odgovoru Treg, blažeg oštećenja tkiva i nižih ocjena.

Taj je slijed tumačenje, a ne dokazan uzročno-posljedični niz. Istraživanje pokazuje da se primjena lijeka, promjene signalizacije i poboljšanje bolesti pojavljuju zajedno. Ne dokazuje da AMPK i SIRT1 posreduju cjelokupan povoljan učinak, a javno indeksirani tekst ne prikazuje točnu dozu u miligramima po kilogramu, put primjene, dan početka ni trajanje dovoljno jasno da bi se režim mogao reproducirati samo na temelju sažetka. Svaku dozu navedenu u vezi s tim radom na prodajnoj stranici smatrajte neprovjerenom ako nije potkrijepljena metodama iz cjelovitog teksta. Šira baza dokaza o metilenskom modrilu u ljudi mjesto je na kojem treba provjeriti je li taj rani imunološki nalaz ikada prerastao u kliničke podatke.

Patološki rezultat: što je pokazalo šest mjeseci praćenja tkiva

U istraživanju MP4 iz 2015. objavljenom u časopisu PLoS ONE upotrijebljene su ženke miševa C57BL/6 imunizirane s 200 mikrograma MP4 u potpunom Freundovu adjuvansu, uz toksin pertusisa na dan imunizacije i ponovno 48 sati poslije. Nijedna životinja nije primila metilensko modrilo kao lijek. Nakon fiksacije i uklapanja poprečni presjeci leđne moždine debljine jednog mikrometra obojeni su metilenskim modrilom za svjetlosnu mikroskopiju, dok je ventrolateralni trakt pregledan elektronskom mikroskopijom radi finijih pojedinosti.

Tkivo je uzorkovano u tri faze: na akutnom vrhuncu kod 7 miševa, tri mjeseca nakon početka kod 5 miševa i šest mjeseci nakon početka kod 10 miševa. Prosječne kliničke ocjene u tim fazama izgledale su gotovo jednako, oko 1.7 do 1.8 na ljestvici od 0 do 5. Tkivo je pokazalo drukčiju sliku. Izolirano oštećenje mijelina poraslo je s oko 569,000 vlakana po kvadratnom milimetru na akutnom vrhuncu na oko 1,496,000 nakon šest mjeseci, pri čemu je usporedba akutne i dugoročne faze bila značajna uz P jednak 0.027. Kombinirano oštećenje mijelina i aksona približno se udvostručilo do šestog mjeseca. Vlakna u procesu remijelinizacije ostala su ispod jednog posto u svakoj fazi, što je otrežnjujući podatak za očekivanja oporavka.

Oštećenje aksona slijedilo je obrazac u obliku slova U: bilo je izraženo na akutnom vrhuncu, manje nakon tri mjeseca, a najveće nakon šest mjeseci. Koreliralo je s oticanjem mitohondrija i smanjenim razmakom između neurofilamenata. Procjena je provedena bez uvida u kliničku ocjenu i fazu, što dodatno podupire tumačenje da su kliničke ocjene podcjenjivale strukturno oštećenje koje se nastavilo razvijati.

Taj je nesklad stvarni doprinos istraživanja čitatelju zainteresiranom za MS. Stabilna ocjena onesposobljenosti nije značila stabilno stanje tkiva. To također pokazuje zašto ovaj rad ne može poduprijeti nijednu tvrdnju o liječenju MS-a metilenskim modrilom. Ispitivao je utjecaj vremena, a ne liječenja.

Zašto nijedno istraživanje ne dokazuje korist za pacijente

Svaki rad promatrajte kao dobar odgovor na usko pitanje, ali ne i kao odgovor na pitanje o pacijentima.

Prvo, uzrok se razlikuje. EAE se namjerno izaziva određenim antigenom i adjuvansom. MS u ljudi razvija se spontano uz širi imunološki repertoar koji uključuje T-stanice, B-stanice, urođenu imunost i rezidentne glijalne stanice. Spoj koji mijenja odgovor usmjeren na MOG u miša ne mora promijeniti taj širi odgovor u ljudi.

Drugo, fenotip se razlikuje. Uzlazna slabost od repa do stražnjih udova u miša praktičan je pokazatelj. Raznolikost MS-a u ljudi svodi na jednu brojčanu ocjenu motoričke funkcije. Lijekovi često mijenjaju kratkoročne ocjene EAE-a bez promjene tijeka bolesti u ljudi, zbog čega je EAE alat za probir i istraživanje mehanizama, a ne minijaturna klinika.

Treće, izloženost i vrijeme primjene ostaju nerazjašnjeni. Kontinuirana primjena započeta rano u pokusu na miševima koji traje 30 dana nije isto što i kronična oralna primjena u osobe s već razvijenom bolešću, a nijedno istraživanje nije mjerilo razine lijeka u živčanom sustavu. Bez te poveznice nema mosta od koncentracije na laboratorijskoj ploči ili doze u miša do režima primjene u ljudi.

Četvrto, ta dva rada ne potvrđuju međusobno svoje rezultate. Različiti antigeni, različita pitanja, različiti ishodi, a u jednom slučaju uopće nema liječenja. Navoditi ih zajedno kao dva pozitivna istraživanja liječenja MS-a znači pogrešno ih svrstati u istu kategoriju.

Što to znači za čitatelje koji procjenjuju dokaze

U tim radovima nema utvrđenog protokola primjene metilenskog modrila za MS. Istraživanje liječenja podupire daljnja istraživanja AMPK, SIRT1, NF-kB i ravnoteže Th17 i Treg u MOG EAE-u. Patološko istraživanje podsjeća da oštećenje tkiva može napredovati dok ocjene izgledaju nepromijenjeno te da metilensko modrilo u odjeljku o metodama ponekad znači posudu s bojom, a ne ormarić s lijekovima. Čitatelji koji prate aktualna istraživanja multiple skleroze trebaju imati na umu tu razliku između boje i lijeka. O sigurnosnim pitanjima, uključujući rizike povezane s krvlju i interakcijama, treba razgovarati s liječnikom uz razmatranje općih podataka o sigurnosti metilenskog modrila prije nego što itko postupi na temelju naslova o laboratorijskim nalazima.

Zaključak stane u jednu rečenicu. U jednom citiranom istraživanju miševi s MOG EAE-om primali su metilensko modrilo te je zabilježena blaža bolest uz protuupalni pomak imunološkog odgovora, dok u drugom citiranom istraživanju nije primijenjeno nikakvo liječenje, a metilensko modrilo služilo je samo za bojenje leđne moždine pri dokumentiranju šestomjesečnog nakupljanja oštećenja mijelina i aksona, pa ta dva rada ne dokazuju da metilensko modrilo pomaže kod MS-a u ljudi.