Metilensko modrilo i feroptoza: željezo, lipidna peroksidacija i stanična smrt

Feroptoza je stanična smrt uzrokovana oštećenjem membrane. Višestruko nezasićene masti u membranama oksidiraju u lančanoj reakciji, membrana gubi funkciju i stanica umire. Za tu je kemijsku reakciju potrebno željezo. Ta rečenica sažima cijeli koncept, a sve u ovom članku ispituje neki njegov dio.

Ovdje je pitanje uže: kako metilensko modrilo djeluje na taj lanac u pokusima na stanicama i što taj rezultat zapravo pokazuje. Kratak je odgovor da je u dvama laboratorijskim istraživanjima metilensko modrilo u nanomolarnim koncentracijama smanjilo mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju i održalo stanice na životu nakon izlaganja okidačima koji inače uzrokuju feroptozu. Dulji je odgovor važniji jer je svaka karika lanca ispitana drukčijom intervencijom, a svaka intervencija ima ograničenja.

Feroptoza u jednom odlomku

Membranski fosfolipid s lancem višestruko nezasićene masne kiseline ima slabu točku: atome vodika koje je lako oduzeti. Kad radikal oduzme jedan od njih, kisik se veže na lipid, nastaje lipidni peroksilni radikal, a taj radikal oduzima vodik sljedećem lipidu. Reakcija se širi duž membrane ako je nešto ne zaustavi.

Glavni mehanizam zaustavljanja enzim je GPX4, koji uz pomoć glutationa reducira lipidne perokside u bezopasne lipidne alkohole. Laboratorijski okidači napadaju tu obranu na točno određenim mjestima. Erastin blokira unos cistina putem sustava xc-minus, čime stanici uskraćuje cistein potreban za sintezu glutationa. Butionin-sulfoksimin izravno blokira sintezu glutationa. RSL3 inhibira sam GPX4. Sva tri ostavljaju perokside neuklonjenima, ali djeluju u različitim koracima, pa se rezultat dobiven s jednim okidačem ne može automatski poopćiti na ostale.

Feroptoza se od apoptoze razlikuje po svojstvima koja je definiraju. Nema kaskade kaspaza ni apoptotičnih tjelešaca. Kelatori željeza poput deferoksamina i sredstva koja hvataju radikale poput ferostatina-1 suzbijaju je, što je operativni test kojim se istraživači služe kako bi smrt označili feroptotičnom, a ne tek nekrotičnom. Širi pregled putova regulirane stanične smrti daje kontekst toj razlici, a način na koji stanice postupaju s labilnim željezom objašnjava zašto je kelacija tako presudna kontrola.

Gdje se uklapaju mitohondriji i zašto je to bilo sporno

Rana istraživanja pokazala su da stanice bez mitohondrijske DNA i dalje podliježu feroptozi, što je upućivalo na to da mitohondriji nisu nužni. Kasnija istraživanja pokazala su da smanjenje broja mitohondrija ili blokiranje respiracije može suzbiti feroptozu uzrokovanu nedostatkom cisteina, ali ne i onu uzrokovanu izravnom inhibicijom GPX4. Oba rezultata mogu biti točna ako doprinos mitohondrija ovisi o okidaču, vrsti stanice i mjestu na kojem se odvija presudna peroksidacija.

Istraživanje na kojem se temelji ovaj članak pristupilo je tom sporu sondom specifičnom za stanični odjeljak. MitoCLox je verzija pokazatelja lipidne peroksidacije usmjerena na mitohondrije: mijenja fluorescenciju kad naiđe na lipidne peroksilne radikale unutar mitohondrija. U fibroblastima tretiranima erastinom oksidacija mitohondrijske sonde pojavila se u još živim stanicama prije smrti i bila je neujednačena među stanicama populacije. Taj je vremenski slijed važan. Peroksidacija koja prethodi smrti mogući je uzrok. Peroksidacija izmjerena samo u mrtvim stanicama ostatak je raspadanja. Popratni vodič o testovima lipidne peroksidacije i onome što svaka sonda pokazuje objašnjava zašto položaj sonde određuje značenje signala.

Isti se obrazac pojavio u drugom modelu. Fibroblasti pacijenta s Leberovom nasljednom optičkom neuropatijom, koji nose mutaciju kompleksa I i imaju višu početnu razinu oksidacijskog stresa, umrli su feroptozom nakon iscrpljivanja glutationa, dok su kontrolni fibroblasti bili otporni. Oksidacija mitohondrijske sonde ponovno se pojavila prva. Pojedinosti su u istraživanju mitohondrijske lipidne peroksidacije tijekom feroptoze u fibroblastima.

Što je metilensko modrilo promijenilo u tim pokusima

Metilensko modrilo redoks je prijenosnik. Njegov oksidirani oblik prihvaća elektrone iz kemijskih reakcija povezanih s NADH-om u kompleksu I, a reducirani ih oblik predaje citokromu c, koji ih prenosi kompleksu IV. Time nastaje djelomična obilaznica oko dijela lanca u kojem elektroni inače prelaze na kisik stvarajući superoksid. Čitatelji koji žele cjelovit prikaz tog prijenosa trebali bi početi s objašnjenjem kako metilensko modrilo prenosi elektrone kroz mitohondrije.

U plućnim fibroblastima tretiranima erastinom metilensko modrilo pri koncentraciji od 250 nanomola po litri očuvalo je vijabilnost prema rezultatima testa preživljavanja stanica, kao i antioksidansi SkQ1 i MitoTEMPO usmjereni na mitohondrije. Kontrole određuju što se može tvrditi. Ferostatin-1, alfa-tokoferol i deferoksamin također su pružili zaštitu, što potvrđuje da je smrt bila feroptotična. Analog SkQ1 bez antioksidacijske skupine nije pružio zaštitu, što upućuje na redoks kemiju, a ne na nespecifično nakupljanje. Zaštita je slabila iznad približno 200 nanomola SkQ1 po litri, u skladu s poznatim prooksidacijskim ponašanjem kinonskih antioksidansa pri većim količinama. Metilensko modrilo pokazuje istu dvojaku ovisnost djelovanja o dozi: u tim je posudama zaštitno pri niskim nanomolarnim razinama, a pri višim razinama ili snažnom osvjetljenju može stvarati vodikov peroksid redoks ciklusima. Takav kontekst doze obrađen je u članku o reaktivnim kisikovim vrstama u mitohondrijima.

Pokusi na izoliranim mitohondrijima zatim su razdvojili izvore ROS-a. U prisutnosti dvovalentnog željeza supstrati koji opskrbljuju kompleks I zajedno s rotenonom potaknuli su oksidaciju sonde. Rotenon blokira prijenos nizvodno od flavinskog mjesta, pa uzvodni prijenosnici ostaju reducirani i prenose elektrone na kisik s flavina okrenutog prema matriksu. Supstrati koji opskrbljuju kompleks III zajedno s antimicinom A proizveli su obilje vodikova peroksida, ali nisu potaknuli lipidnu peroksidaciju. Isti ukupni signal ROS-a, drugo mjesto, drukčiji ishod. SkQ1 i metilensko modrilo pojedinačno su suzbili peroksidaciju potaknutu kompleksom I, a da nisu suzbili samu proizvodnju vodikova peroksida, što njihovo djelovanje smješta nakon nastanka ROS-a, u korak lipidne peroksidacije.

Dio istraživanja s preopterećenjem željezom i trag lipofuscina

Drugo je istraživanje pristupilo pitanju sa strane željeza. U kardiomiocitima H9c2 izloženima submilimolarnim koncentracijama željezova(III) amonijeva citrata pojavili su se mitohondrijski ROS, mitohondrijska lipidna peroksidacija, zatim feroptoza, nakon čega se unutar 24 sata nakupio pigment sličan lipofuscinu. Lipofuscin je autofluorescentni ostatak oksidiranih lipida i proteina koji sadržava željezo i nakuplja se s dobi, a njegova brza pojava ovdje povezuje akutnu peroksidaciju potaknutu željezom s klasičnim biljegom starenja. Metilensko modrilo i SkQ1 u nanomolarnim koncentracijama pojedinačno su spriječili peroksidaciju, smrt i nakupljanje pigmenta. Izolirani srčani mitohondriji potvrdili su obrazac: rotenon zajedno s dvovalentnim željezom potaknuo je peroksidaciju i signal nalik pigmentu, a oba su sredstva to blokirala. Cijeli slijed opisan je u istraživanju preopterećenja željezom u kardiomiocitima H9c2. Dio priče o pigmentu povezan je s lipofuscinom i biljezima staničnog starenja.

Što testovi preživljavanja stanica ne pokazuju

Test vijabilnosti poput CellTiterBlue pokazuje koliko stanica u posudi ostaje metabolički aktivno nakon izlaganja okidaču i potencijalnom zaštitnom sredstvu. To je ispitivanje mehanizma u definiranom sustavu. Nije ishod liječenja. Ni u jednom od tih pokusa nije primijenjena doza pacijentu, mjeren ishod bolesti ni utvrđen terapijski raspon u organizmu.

Četiri ograničenja treba izričito navesti. Prvo, izbor vrsta stanica uzak je: transformirani plućni fibroblasti, primarni kožni fibroblasti, uključujući jednu liniju s mitohondrijskom bolešću, i linija štakorskih kardiomiocita, uz izolirane mitohondrije štakorskog srca. Osjetljivost je varirala među linijama, a linija LHON namjerno je odabrana zbog neuobičajene osjetljivosti. Drugo, okidači su laboratorijski ekstremi: potpuna blokada transporta ili sinteze te opterećenja željezom kojima nijedno tkivo ne bi bilo akutno izloženo. Treće, koncentracija se ne može preračunati jednostavnim množenjem. Nanomolarna koncentracija u mediju za uzgoj stanica nije doza za čovjeka, a raspodjela metilenskog modrila, redukcija u njegov bezbojni oblik u krvi i tkivu, izloženost svjetlosti i membranski potencijal čimbenici su koji stoje između posude i čovjeka. Četvrto, sonde izvještavaju o vlastitom odjeljku. Oksidacija MitoCLox pokazuje da su nastali mitohondrijski lipidni radikali; ne pokazuje da je pucanje plazmatske membrane, vjerojatni završni događaj, spriječeno izravno, a ne izbjegnuto djelovanjem na raniji korak.

Stoga je utemeljena tvrdnja sljedeća: u tim modelima ROS nastao u kompleksu I zajedno sa željezom potiče mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju koja prethodi feroptozi, a metilensko modrilo u niskim koncentracijama prekida taj dio lanca. Za sve što nadilazi taj dio potrebni su drukčiji pokusi na životinjama, a zatim na ljudima.