Metilensko modrilo: antioksidans ili prooksidans? Što mijenja ishod

Zamislite da dva laboratorija ispituju isto plavo bojilo i izvijeste o suprotnim rezultatima. U prvom izolirani mitohondriji mozga bolje respiriraju i proizvode više ATP-a. U drugom isti pripravak oslobađa mnogo više vodikova peroksida. Oba su izvješća točna. Opisuju isti ciklus promatran s dvaju krajeva, a zabuna nastaje kada čitatelji jedan kraj smatraju cijelom pričom.

Pogreška je pitati koja oznaka odgovara molekuli. Metilensko modrilo prenosi elektrone, što karta njegovih meta u staničnoj biologiji prikazuje u širem kontekstu. Oksidirano bojilo prihvaća elektrone i postaje bezbojni leucoMB. LeucoMB predaje te elektrone dalje i ponovno postaje plav. Ono što opažate ovisi o tome tko daje elektrone, tko ih prima i može li sustav ukloniti vodikov peroksid koji pritom nastaje. Pitanje koje vrijedi postaviti nikada nije je li bojilo antioksidans. Pitanje je što uvjeti omogućuju tom prijenosniku.

Ciklus koji stvara oba lica

U mraku je osnovni ciklus kratak. NADH, NADPH ili prijenosnici u respiracijskom lancu reduciraju bojilo. Reducirano bojilo zatim ima nekoliko konkurentnih puteva. Može predati elektrone citokromu c i podržati njihov protok zaobilazeći oštećeni kompleks, zbog čega se respiracija i membranski potencijal djelomično oporavljaju pri blokadi kompleksa I ili III. Ili može predati elektrone izravno kisiku, čime obnavlja plavi oblik i stvara vodikov peroksid. Budući da se bojilo obnavlja, mala količina može mnogo puta ponoviti ovaj ciklus, neprestano trošeći redukcijske ekvivalente i stvarajući peroksid.

Dvije dodatne grane potpuno mijenjaju kemiju. Slobodni bakar ili željezo pretvaraju taj peroksid koji može difundirati u mnogo razornije lokalne oksidanse putem reakcija Fentonova tipa. Crvena svjetlost otvara zasebnu fotokemijsku granu u kojoj pobuđeno bojilo prenosi energiju kisiku i stvara singletni kisik, vrstu detaljno obrađenu u objašnjenju fotokemije tipa I i tipa II. Redoks-cikliranje u mraku, oštećenje pojačano metalima i fotodinamičko oštećenje tri su različita mehanizma kojima je zajednička ista početna molekula.

Matrica uvjeta i ishoda

Tablicu u nastavku vrijedi sačuvati. Svaki redak prikazuje jednu varijablu, smjer u kojem ona utječe na ishod i pokus koji to potkrepljuje. Pozitivno znači zaštitni ili poboljšani mjerni rezultat. Nepovoljno znači više oksidansa, veće iscrpljivanje ili više oštećenja.

Uvjet	Smjer ishoda	Što je pokus pokazao
Niska koncentracija, 0.1 do 1 uM, izolirani mitohondriji	Pozitivan bioenergetski učinak uz više peroksida	0.1 uM poboljšalo je potrošnju kisika u mitohondrijima srca zdravih i dijabetičnih štakora; 100 nM do 1 uM djelomično je obnovilo ATP, membranski potencijal i unos kalcija u blokiranim mitohondrijima mozga, dok se oslobađanje peroksida povećalo u svim uvjetima
Viša koncentracija, iznad 5 uM, stanice bez glukoze	Nepovoljan oksidacijski signal	Endotelne stanice oksidirale su opću ROS sondu i gubile reducirani glutation iznad 5 uM kada glukoza nije bila prisutna; dodavanje glukoze spriječilo je oboje
Supstrati kompleksa I (glutamat i malat)	Više peroksida	I istraživanja mitohondrija mozga i istraživanja mitohondrija srca utvrdila su povećano oslobađanje peroksida uz supstrate povezane s NADH-om
Sukcinat i rotenon, mitohondriji srca, 0.1 uM	Manje peroksida u tom protokolu	Jedini jasno antioksidativan rezultat mjerenja peroksida u ovom skupu; imajte na umu da je protokol uključivao rotenon i drugo tkivo, pa sam supstrat to ne objašnjava
Crvena svjetlost, 20 uM uz 630 nm	Nepovoljno oštećenje DNA	Bez značajnih lezija mitohondrijske DNA u mraku pri 20 uM; ista koncentracija uz crvenu svjetlost oštetila je svaki ispitani fragment
Vrlo visoka koncentracija u mraku, 100 uM	Nepovoljno selektivno oštećenje DNA	Selektivne lezije mitohondrijske DNA u sekvencama bogatim purinima, kvalitativna promjena u odnosu na peroksidni signal pri nanomolarnim koncentracijama
Bakar ili željezo uz NADH, DNA u sustavu bez stanica	Nepovoljne oksidativne lezije	Bakar je usmjerio oštećenje na sekvencu mutacijskog žarišta p53; željezo EDTA uzrokovalo je široko rasprostranjeno oštećenje; katalaza i kelatori metala blokirali su odgovarajuće puteve; količina oksidiranog gvanina povećala se
Prisutna glukoza, intaktne stanice	Zaštitno ublažavanje unatoč bržem cikliranju	Glukoza je povećala redukciju bojila, ali smanjila neto stres, što je u skladu s opskrbom NADPH-om iz pentoza-fosfatnog puta za obnavljanje antioksidansa
Stanice obogaćene askorbatom	Mješovito: askorbat potrošen, signal sonde ublažen	Bojilo je postupno oksidiralo unutarstanični askorbat čak i uz prisutnu glukozu, istodobno djelomično suzbijajući oksidaciju sonde; trošak su snosile obrambene zalihe
Životinje prethodno tretirane rotenonom, bojilo dano prvo	Pozitivan ishod u tkivu	Prethodni tretman bojilom smanjio je lezije mitohondrijske DNA izazvane rotenonom u srednjem mozgu miša unatoč povećanju peroksida u izoliranim mitohondrijima

Bit je u obrascu koji se vidi kroz sve retke. Stvaranje peroksida i biološka zaštita zasebne su osi. Tretman može istodobno imati nepovoljan rezultat na prvoj i pozitivan na drugoj.

Zašto ista doza daje različite odgovore

Koncentracija određuje kapacitet prijenosa, a ne konačni ishod. Oslobađanje peroksida iz mitohondrija mozga mjerljivo se povećavalo od 50 nM naviše u istraživanju intaktnih mitohondrija mozga, dok je za jasno oštećenje mitohondrijske DNA u mraku bilo potrebno 100 uM. To je približno dvije tisuće puta veća koncentracija između prvog signala i genotoksičnosti, ali to nije sigurnosna margina. Krajnji pokazatelji, odjeljci i trajanja izlaganja razlikuju se, pa te brojke označavaju različite pojave, a ne točke na jednoj krivulji. Rasprava o odnosu doze i odgovora smješta takav razmak između slabog signala i velikog oštećenja u širi kontekst hormeze.

Supstrat određuje gdje elektroni ulaze. Izvori energije povezani s NADH-om daju bojilu obilje redukcijskih ekvivalenata i za koristan zaobilazni put i za rasipnu reakciju s kisikom. Često citirana tvrdnja da sukcinat čini bojilo antioksidansom, a glutamat prooksidansom izvodi iz podataka više nego što oni pokazuju, jer je uvjet za mjerenje peroksida sa sukcinatom u istraživanju srca također sadržavao rotenon te je uključivao drugo tkivo i dozu nego istraživanje mozga koje je utvrdilo povećanje peroksida uz svaki supstrat i u svakom stanju respiracije.

Svjetlost mijenja mehanizam, a ne samo jačinu učinka. Najjasnija usporedba u ovom skupu jest 20 uM u mraku, bez mjerljivog učinka na fragmente mitohondrijske DNA, nasuprot 20 uM pod crvenom svjetlošću, što je oštetilo sve fragmente. Svatko tko uspoređuje pokus uz svjetlost s pokusom u mraku uspoređuje fotokemiju s redoks-cikliranjem.

Metali pretvaraju oksidans. Bez metala ciklus bojila u mraku stvara peroksid, molekulu koja može difundirati i koju stanice koriste i kao signal. Uz dostupan bakar ili željezo, bojilo reducirano NADH-om potiče redukciju metala, a reducirani metal aktivira peroksid stvarajući vrste hidroksilnog tipa ili vrste bakrova peroksida uz DNA. Tako je istraživanje u sustavu bez stanica s NADH-om i metalnim ionima iz istog početnog bojila proizvelo i oštećenje DNA selektivno za mutacijska žarišta i široko rasprostranjeno oštećenje. Način na koji odjeljak upravlja metalima, a ne samo bojilo, određuje je li ta grana važna.

Dostupnost izvora energije određuje može li stanica podnijeti trošak. U endotelnim stanicama izloženima koncentracijama bojila od 2 do 20 uM uklanjanje glukoze razotkrilo je oksidacijski trošak, dok ga je opskrba glukozom uklonila, iako je glukoza ujedno ubrzala redukciju bojila. Brže cikliranje uz opskrbljenu obranu bolje je od sporijeg cikliranja uz iscrpljenu obranu. Svaku tvrdnju o oksidansima koja izostavlja dostupnost glukoze ili NADPH-a smatrajte nepotpunom.

Tkivo određuje raspoloživu opremu. Endotelne stanice obnavljaju NADPH metabolizmom glukoze i imaju citosolne zalihe antioksidansa. Izolirani mitohondriji nemaju ništa od toga. Pročišćena DNA nema čak ni mogućnost popravka. Rezultat u jednom pripravku malo govori o ostalima, zbog čega će planirani članak o odgovorima specifičnima za tkivo morati te sustave razmatrati odvojeno.

Izravno mjerenje nije naknadna obrana

Mnogi tekstovi stapaju dvije razine koje pokusi drže odvojenima. Jedna razina pita koliko je oksidansa nastalo. Druga pita kako je stanica odgovorila.

Testovi za peroksid tipa Amplex najbliži su prvoj razini, a čak i oni prikazuju neto tok, odnosno proizvodnju umanjenu za razgradnju i izvoz. Istraživanje mitohondrija mozga utvrdilo je promjene na obje strane: stvaralo se više peroksida, a dodani bolus peroksida uklanjao se sporije. Dalje nizvodno nalaze se oksidacija glutationa, potrošnja askorbata, oksidirani gvanin i lezije DNA koje blokiraju polimerazu. Svaki korak dodaje biološke procese između oksidansa i mjernog rezultata.

Antioksidativni enzimi čiju ekspresiju potiče Nrf2 i mitohondrijska biogeneza pripadaju drugoj razini. To su prilagodbeni programi koje može pokrenuti blagi puls peroksida, a autori istraživanja zaštite mitohondrija mozga predlažu upravo takav blagi stresni okidač, uz napomenu da se uzročni lanac preko Nrf2 temelji na prethodnim istraživanjima, a ne na njihovu vlastitom potpunom dokazu. Zaštita koja nastupa satima poslije zahvaljujući novim proteinima ne znači da je početna kemija bila antioksidativna. Znači da je mali prooksidativni događaj omogućio veću obranu. Smjernice za tumačenje takvih tvrdnji, uključujući ograničenja testova i razlike među pripravcima, tema su vodiča za čitanje istraživanja o metilenskom modrilu.

Zašto testovi daju različite rezultate

Opća sonda poput dihidrofluoresceina pokazuje nespecifičnu oksidaciju sonde, a ne koncentraciju peroksida. Ovisi o kemiji peroksidaza i hema te može propustiti porast peroksida koji kalibrirani test Amplex bilježi. Istraživanje mitohondrija mozga zabilježilo je izrazito višu razinu peroksida bez odgovarajućeg signala superoksida, što upozorava na oprez pri citiranju bilo koje pojedinačne tvrdnje o antioksidativnom učinku koja se temelji na sondi s bojilom. Optičko preklapanje opravdano je pitanje za kontrolni pokus jer bojilo apsorbira vidljivu svjetlost blizu uobičajenih pobudnih i emisijskih pojaseva, no u pažljivo provedenom istraživanju mjerenja su kalibrirana prema poznatim koncentracijama peroksida, izloženost pobudnoj svjetlosti smanjena je uz malu promjenu signala, a sporije uklanjanje peroksida potvrđeno je zasebnom elektrodom. Interferenciju treba provjeriti kontrolnim pokusom, a ne automatski odbaciti rezultate.

Rezultat za kalcij pokazuje istu potrebu za preciznošću. Akutna primjena bojila nije promijenila ukupno opterećenje kalcijem prije prijelaza propusnosti u istraživanju srca, ali je poboljšala brzinu unosa kalcija u blokiranim mitohondrijima mozga u istraživanju mitohondrija srca usmjerenom na dijabetes. Različiti krajnji pokazatelji, različiti sustavi, bez proturječja.

Kontrolni popis prije prihvaćanja zaključka

Svaki zaključak o antioksidativnom ili prooksidativnom djelovanju promatrajte kao izvješće o određenom sustavu i postavite pet pitanja. Pri kojoj koncentraciji i u kojem odjeljku? S kojim donorom elektrona i kojim konkurentnim akceptorom? Na svjetlu ili u mraku, te pri kojoj valnoj duljini i dozi? Koji su metali dostupni i kakva je opskrba izvorima energije i zalihama antioksidansa? I kojim se testom mjeri tok oksidansa, oštećenje ili prilagodbeni odgovor? Promijenite bilo koji odgovor i ista molekula može prijeći unutar matrice iz zaštitne u štetnu, bez ikakva paradoksa.