Zašto se apsorpcija metilenskog modrila mijenja s koncentracijom

Uzmite jednu bocu matične otopine metilenskog modrila i napunite dvije čaše. Prvu napunite matičnom otopinom, a drugu deseterostruko razrijeđenom otopinom. Druga je čaša bljeđa, kao što se i očekuje. Pogledate li pažljivo, primijetit ćete još jednu promjenu. Nijansa se promijenila. Jedna otopina poprima čistu nebeskoplavu boju, a druga plavu s ljubičastim tonom. Razrjeđivanje nije samo smanjilo intenzitet. Promijenilo je kemijsku vrstu koja najviše pridonosi apsorpciji.

Objašnjenje te promjene jednostavno je. Otopljeno metilensko modrilo nije samo jedna kemijska vrsta. Pojedinačni kation bojila, nazvan monomer, može se plošno složiti s drugim kationom i tvoriti dimer, a dimeri mogu prerasti u veće agregate. Svaki oblik ima vlastiti apsorpcijski spektar. Ono što spektrofotometar očitava zbroj je doprinosa svih vrsta u smjesi prisutnoj u toj kiveti, u tim uvjetima. Promijenite smjesu i spektar se mijenja, čak i kada ukupni sadržaj bojila slijedi jednostavan omjer razrjeđivanja.

Monomer i dimer različito apsorbiraju

Zamislite monomer kao ravnu kartu s pozitivnim nabojem raspoređenim po prstenastom sustavu. Dvije takve karte mogu ležati jedna na drugoj, okrenute plohama jedna prema drugoj. Pozitivni naboji se odbijaju, ali ravne aromatske površine privlače se interakcijama slaganja, dok okolna voda i protuioni zasjenjuju odbijanje. Rezultat je vezani par sa zajedničkim elektronskim stanjima. Njegovi dopušteni prijelazi imaju višu energiju od prijelaza monomera, pa se vrpca dimera pojavljuje na kraćoj valnoj duljini od vrpce monomera, dok veći agregati dodatno pridonose na plavoj strani spektra u obliku ramena.

Pri vrlo niskoj koncentraciji u čistoj vodi prevladavaju monomeri i dominira vrpca na duljoj valnoj duljini. Kako ukupna koncentracija raste, udio uparenog oblika povećava se, a vrpca na kraćoj valnoj duljini raste u odnosu na prvu. Omjer tih dviju vrpci stoga pokazuje sastav smjese, a ne izravno ukupnu koncentraciju. Očitanje na jednoj valnoj duljini ne može razlučiti ta dva oblika bez pretpostavke o tome koji je oblik prisutan.

Zato se referentni spektri uvijek moraju navoditi zajedno s uvjetima. Spektralni referentni podaci za metilensko modrilo donose tablične položaje vrpci uz otapalo, sastav soli u mediju, pH, temperaturu i raspon koncentracija pri kojima su dobiveni. Navedete li maksimum bez tih uvjeta, broj nije dovoljno određen. Dva laboratorija mogu ispravno navesti različite spektre istog bojila jer su mjerila različite smjese.

Što pomiče ravnotežu

Koncentracija je glavni čimbenik. Za nastanak dimera moraju se susresti dva monomera, pa njegov udio raste brže od ukupne koncentracije bojila. Objavljene konstante dimerizacije u vodi blizu sobne temperature reda su tisuća po molaru, pa udio dimera naglo raste u mikromolarnom rasponu. Opsežna globalna prilagodba modela podacima od mikromolarnih do milimolarnih koncentracija bojila utvrdila je doprinos tetramera različit od nule već ispod 34 mikromolara, što upozorava da se pri desecima mikromolara ne treba pouzdati u model ograničen na dvije kemijske vrste. Točni udjeli ovise o mediju, zbog čega ovaj članak navodi smjerove promjena, a ne univerzalnu tablicu pretvorbe.

Sol je drugi čimbenik. Otopljeni ioni zasjenjuju odbijanje između dvaju kationa, pa dodani natrijev klorid i slični elektroliti pomiču smjesu prema dimerima i agregatima pri istoj koncentraciji bojila. Taj je učinak vidljiv u istraživanjima agregacije metilenskog modrila u slanim i vodenim medijima, u kojima je bojilo u rasponu od približno 1 mikromolara do 3.4 milimolara mjereno pri koncentracijama natrijeva klorida od 0 do 0.15 molara. U toj je prilagodbi modela udio tetramera dosegnuo približno 0.93 pri visokim koncentracijama bojila i soli. Spektar snimljen u vodi i spektar snimljen u fiziološkoj otopini stoga nisu međusobno zamjenjivi standardi.

Temperatura djeluje u suprotnom smjeru. Slaganje oslobađa vezanu vodu, a toplinsko gibanje mu se suprotstavlja, pa zagrijavanje otopine obično razdvaja dio dimera natrag u monomere, dok hlađenje pogoduje udruživanju. Entalpija disocijacije dobivena prilagodbom modela negativna je, približno minus 30 kilodžula po molu u rasponu od 282 do 333 kelvina, što potvrđuje egzotermno udruživanje. Hladan uzorak izmjeren neposredno nakon čuvanja u hladnjaku može izgledati više agregirano nego isti uzorak izmjeren nakon uravnoteženja na sobnoj temperaturi.

Otapalo određuje polazište. Voda svojim snažnim hidrofobnim učinkom potiče slaganje ravnih kationa bojila. Alkoholi poput etanola i metanola bolje solvatiraju prstenove i razbijaju agregate, pa pri istoj koncentraciji bojila u etanolu monomerni oblik prevladava više nego u vodi. Aprotična suotapala djeluju slično: u smjesama vode i DMSO-a pri 293 kelvina dodani DMSO potisnuo je dimerizaciju, što upućuje na strukturu vode kao pokretač slaganja. Površinski aktivne tvari zahtijevaju oprez u oba smjera. Iznad njihove kritične micelarne koncentracije micele mogu pojedinačno solubilizirati monomere i vratiti spektar nalik monomernom. Ispod te granice površinski aktivna tvar suprotnog naboja može, naprotiv, potaknuti slaganje: pri koncentraciji bojila od 100 mikromolara polimerizacija potaknuta SDS-om dosegnula je maksimum blizu 4 milimolara SDS-a, približno na polovini kritične micelarne koncentracije, prije preraspodjele pri višim koncentracijama površinski aktivne tvari. Istraživanje učinaka međudjelovanja bojila i otapala te organiziranih medija na spektre metilenskog modrila pokazuje koliko snažno neposredno molekularno okruženje, a ne samo ukupna koncentracija, određuje opažene vrpce.

pH je važan uglavnom na krajnjim vrijednostima. U približno neutralnom rasponu koji se koristi u većini laboratorijskih postupaka metilensko modrilo ostaje u svojem poznatom plavom kationskom obliku, a agregacija ima glavnu ulogu u spektralnim promjenama. Jaka kiselina ili lužina, redoks-kemija koja stvara bezbojni leuko-oblik te vezanje na proteine i čestice dodaju stanja izvan para monomer–dimer. Kada se spektar promijeni nakon dodavanja pufera, provjerite sadrži li pufer soli i komponente koje sudjeluju u vezanju prije nego što sve pripišete samo pH-u. Referentni tekst o kemiji i protonaciji razmatra ta pitanja identiteta odvojeno od pitanja agregacije obrađenog ovdje.

Zašto se pravac Beer-Lambertova zakona zakrivljuje

Beer-Lambertov odnos kaže da je apsorbancija jednaka umnošku apsorptivnosti, koncentracije i duljine optičkog puta. To je zakon koji se temelji na brojanju. Pretpostavlja da objekti koje brojimo ostaju jednaki dok se njihov broj mijenja: jedna apsorbirajuća kemijska vrsta, nepromjenjiv spektar, bez kemijskih promjena s koncentracijom, monokromatska mjerna svjetlost, bez raspršenja ili ponovne emisije te svjetlost koja doista prolazi navedenim putem.

Agregacija narušava prvu pretpostavku. Formalno, ukupna apsorbancija ostaje zbroj doprinosa pojedinih kemijskih vrsta: duljina optičkog puta pomnožena s apsorptivnošću svake vrste i njezinom koncentracijom. Svaka vrsta poštuje zakon. Smjesa ne, jer su koncentracije pojedinih vrsta nelinearne funkcije ukupne koncentracije bojila. Kalibracijska krivulja apsorbancije na vrpci monomera u odnosu na ukupnu koncentraciju bojila zato je u granici velikog razrjeđenja pravac, a s porastom koncentracije zakrivljuje se prema dolje jer svaki dodani prirast donosi razmjerno manje monomera. Krivulja očitana na vrpci dimera zakrivljuje se u suprotnom smjeru. Istraživanja agregacije upravo taj mehanizam ističu kao izvor opaženih odstupanja od Lambert-Beerova zakona. Prilagodba pravca zakrivljenom području i njegova ekstrapolacija uobičajena su pogreška. Pravac vrijedi samo unutar raspona i matrice u kojima je izrađen.

Razrjeđivanje stvara sličnu zamku. Razrjeđivanje koncentrirane matične otopine radi ulaska u mjerni raspon instrumenta ne čuva omjer kemijskih vrsta. Razrijeđena otopina u kiveti ponovno uspostavlja ravnotežu pomaknutu prema monomeru, pa njezin spektar ispravno opisuje razrijeđeni uzorak, ali neispravno opisuje matičnu otopinu. Povratni izračun spektra matične otopine povećavanjem vrijednosti apsorbancije vraća procjenu ukupnog sadržaja samo ako kalibracija već uzima u obzir taj pomak. Nikada ne vraća izvorni oblik vrpci. Svatko tko uspoređuje spektar koncentrata s razrijeđenim referentnim uzorkom uspoređuje dvije različite smjese.

Duljina optičkog puta dio je rezultata

Apsorbancija je razmjerna udaljenosti koju svjetlost prijeđe kroz uzorak. Kiveta od 10 mm daje deset puta veću apsorbanciju od kivete od 1 mm s istom otopinom. Ta je proporcionalnost točna samo za istu otopinu, a zbog agregacije taj je uvjet ključan.

U praksi duljina optičkog puta služi za ostanak unutar valjanog raspona. Dug optički put pruža osjetljivost za razrijeđene, pretežno monomerne otopine. Kratak optički put zadržava koncentrirani uzorak unutar mjernog raspona bez velikog razrjeđivanja koje bi ponovno uspostavilo ravnotežu. U istraživanju agregacije iz kojeg potječu prethodno navedeni brojevi primijenjeno je upravo to: kivete od 1 centimetra za bojilo od 1.1 do 34 mikromolara te kivete od 0.01 centimetra za raspon od 94 mikromolara do 3.4 milimolara. Mjerne platforme za mikrovolumene i čitači mikrotitarskih ploča imaju vlastitu geometriju, s kratkim i ponekad promjenjivim optičkim putovima te površinama na koje se kationsko bojilo može adsorbirati. Uz broj navedite i duljinu optičkog puta, kao što spektralni referentni podaci navode otapalo i sol. Apsorbancija bez duljine optičkog puta nije rezultat. To je glasina.

Mjerna disciplina proizlazi iz mehanizma. Prije očitanja uravnotežite uzorke na istoj temperaturi. Koristite isti tip i orijentaciju kivete, odgovarajuće slijepe uzorke s istim sastavom soli i pufera te čisto laboratorijsko posuđe jer se metilensko modrilo adsorbira na staklo i plastiku, a obojena kiveta nosi trag prethodnog koncentriranog uzorka. Očitajte uzorke ubrzo nakon pripreme kada je kinetika agregacije važna i izradite svaku kalibracijsku krivulju u istoj matrici i pri istoj duljini optičkog puta kao za nepoznate uzorke. Pri vizualnim provjerama imajte na umu da je oko loš spektrometar. Može li se bojom otopine utvrditi čistoća zasebno je pitanje na koje je odgovor negativan, a promjene nijanse zbog agregacije jedan su od razloga.

Dijagram koji treba držati uz instrument

Slika u nastavku sažima članak u jedan laboratorijski podsjetnik. Tri otopine sadrže isto bojilo, ali se razlikuju po ukupnoj koncentraciji i sastavu soli u mediju. Njihovi shematski spektri pokazuju kako dugovalna vrpca monomera gubi udio u korist kraćovalne vrpce dimera s povećanjem slaganja. Uvjeti su navedeni na slici jer se bez njih krivulje ne mogu ponovno koristiti. Za izmjerene položaje vrpci u navedenim uvjetima koristite spektralne referentne podatke. O tome kako bojilo ulazi u stanice nakon što je u otopini pročitajte ulazak u stanice redukcijom i raspodjelom između faza. O tome kako doza svjetlosti i geometrija dodatno oblikuju fotokemijska očitanja pročitajte izlaganje svjetlosti i geometrija mjerenja.

Pravilo koje treba zapamtiti ima dva dijela. Spektar identificira smjesu prisutnu u kiveti u navedenim uvjetima. Samo kalibracija izrađena u tim istim uvjetima pretvara apsorbanciju u ukupnu koncentraciju.