Članak
Alternative metilenskom plavilu za mikroskopiju: odaberite prema zadatku
Za jednostavan razmaz bakterija kristal-violet može zamijeniti metilensko plavilo kada je cilj vidjeti oblik stanica. Za žive stanice bolja alternativa može biti fazni kontrast bez ikakvog bojenja. Izbor ovisi o opažanju koje trebate provesti.
Pretpostavimo da dvije osobe promatraju istu bakterijsku kulturu. Jedna želi razlikovati štapićaste od okruglih stanica. Druga želi saznati je li tretman ubio bakterije. Bojilo koje prvoj osobi daje jasnu sliku drugoj možda neće dati nikakav upotrebljiv odgovor.
Prije odabira zamjene dovršite ovu rečenicu: „Moram promatrati ___ u ___, a stanice moraju / ne moraju ostati žive.” Ta rečenica definira zadatak koji bojilo mora ispuniti.
Počnite od uzorka i pitanja
Najprije odlučite moraju li stanice ostati žive, a zatim odredite značajku koju trebate promatrati:
- Stanice moraju ostati žive: za kretanje ili oblik razmotrite fazni kontrast bez bojenja ili DIC; za nuklearnu DNA razmotrite Hoechst 33342 uz fluorescenciju; za integritet membrane odaberite validirani test kao što je SYTO 9 s propidijevim jodidom.
- Stanice ne moraju ostati žive: za morfologiju bakterija razmotrite jednostavno bojenje kristal-violetom ili negativno bojenje nigrozinom; za Gramovu reakciju upotrijebite cjelovitu metodu bojenja po Gramu; za nuklearnu DNA u fiksiranim stanicama razmotrite fluorescenciju s DAPI-jem.
Ovom tablicom usporedite ograničenja svake mogućnosti. Riječ je o izboru metode, a ne o uputama za zamjenu bočica unutar postojećeg protokola.
| Što trebate promatrati | Uzorak i oprema | Moguća alternativa | Glavno ograničenje |
|---|---|---|---|
| Oblik i raspored bakterija | Pripremljeni razmaz bakterija; svijetlo polje | Jednostavno bojenje kristal-violetom | Prikazuje morfologiju; ne utvrđuje Gramovu reakciju ni vijabilnost. |
| Obrisi stanica na tamnoj pozadini | Bakteriološki preparat; svijetlo polje | Negativno bojenje nigrozinom | Priprema i formulacija su važne; neobojena stanica nije nužno živa. |
| Gramova reakcija | Pripremljeni razmaz bakterija; svijetlo polje | Cjelovita metoda bojenja po Gramu | Zahtijeva puni slijed reagensa i kontrole. |
| Kretanje ili promjene u živim stanicama | Kompatibilni vlažni preparat; fazni kontrast ili DIC | Bez bojila | Zahtijeva odgovarajuću optiku; kontrast ne identificira molekulu. |
| Nuklearna DNA | Fiksirane stanice; fluorescencija | DAPI | Zahtijeva kompatibilne filtre za pobudu i emisiju. |
| Nuklearna DNA u živim stanicama | Žive stanice; fluorescencija | Hoechst 33342 | Ulazak u stanicu ne potvrđuje da su uvjeti snimanja bezopasni. |
| Integritet bakterijske membrane | Nefiksirane bakterije; fluorescencija | SYTO 9 s propidijevim jodidom | Bojenje membrane neizravna je mjera vijabilnosti. |
Kod jednostavnog razmaza pažljivo zamijenite metodu
Kristal-violet praktičan je kandidat kada je zadatak dobiti jednobojni prikaz morfologije bakterija. FDA-ov Bacteriological Analytical Manual navodi dvije formulacije kristal-violeta prikladne za jednostavno bojenje. Upotrijebite dokumentiranu formulaciju i pripadajući postupak pripreme; sam naziv bojila ne određuje radni reagens.
Kristal-violet koristi se i u bojenju po Gramu, ali to ne znači da je jednostavno bojenje kristal-violetom isto što i bojenje po Gramu. U ASM-ovu protokolu bojenja po Gramu diferencijalni rezultat ovisi o uzastopnom djelovanju kristal-violeta, joda, obezbojavanja i kontrastnog bojenja. Izostavljanje tih koraka mijenja ono što se slikom može utvrditi. Za tu razliku pogledajte jednostavno bojenje nasuprot bojenju po Gramu.
Nigrozin omogućuje drukčiji način prikaza obrisa: zatamnjuje pozadinu, dok bakterijske stanice ostaju razmjerno svijetle. U Merckovim uputama za nigrozin nalazi se važan detalj koji općeniti popis zamjena može previdjeti. Njihova navedena radna formulacija sadrži formaldehid. Stoga se kompatibilnost sa živim stanicama ne može zaključiti iz izraza „negativno bojenje”, iako same stanice izgledaju neobojeno. Provjerite potpunu formulaciju i pripremu uzorka.
Za žive uzorke razmotrite promjenu optike
Ako želite promatrati kretanje ili dijeljenje stanica, uvođenje dodatnog bojila može zakomplicirati opažanje. Kao što Nikon objašnjava u vodiču o kontrastu u prozirnim uzorcima, fazni kontrast i diferencijalni interferencijski kontrast, odnosno DIC, čine uzorke vidljivima zahvaljujući razlikama u njihovim optičkim svojstvima. Mogu prikazati žive, neobojene stanice ako mikroskop ima potrebne komponente.
Ovim se izborom zadržava neobojeni preparat, ali se mijenja vrsta dostupnih informacija. Možete pratiti granicu ili kretanje, a da pritom ne znate koja je molekula stvorila kontrast. Ako je pitanje molekularna lokalizacija, odaberite odgovarajuću metodu označavanja.
Za nuklearnu DNA Invitrogenova usporedba bojila DAPI i Hoechst razlikuje uobičajenu primjenu DAPI-ja s fiksiranim stanicama od stanično propusnijeg Hoechsta 33342, koji se preferira za označavanje živih stanica. Oba zahtijevaju opremu za fluorescenciju. Nijedno nije izravna zamjena za obojeno bojilo za mikroskopiju u svijetlom polju.
Izloženost bojilu i osvjetljenje tretirajte kao eksperimentalne uvjete. Kada mjerite ponašanje stanica, usporedite obojene i neobojene preparate.
Crvena stanica nije automatski mrtva stanica
SYTO 9 i propidijev jodid često se upotrebljavaju zajedno za procjenu integriteta bakterijske membrane. Priručnik BacLight povezuje neoštećene membrane sa zelenim bojenjem, a oštećene membrane s crvenim bojenjem. Takvo tumačenje treba validirati za konkretni uzorak.
Studija Rosenberga i suradnika iz 2019. pokazuje u čemu je problem. U 24-satnim biofilmovima E. coli na staklu u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom oko 96% stanica in situ izgledalo je pozitivno na propidijev jodid. Ipak, autori su procijenili da je nakon prikupljanja 82% stanica bilo sposobno za uzgoj. Konfokalne slike pokazale su stanice sa zelenom unutrašnjošću ispod crveno obojenog materijala, što upućuje na izvanstanične nukleinske kiseline kao uzrok pogrešnog signala.
Ti postoci opisuju različita mjerenja na preparatima iz te studije, a ne univerzalni korekcijski faktor. Korisna je pouka provjeriti što je proizvelo signal. U biofilmu bojilo za nukleinske kiseline može detektirati materijal izvan stanica, kao i unutar oštećenih stanica. Za zaključak o vijabilnosti istraživači preporučuju komplementarna mjerenja, poput uzgoja ili metaboličke aktivnosti, uz napomenu da svako od njih ima ograničenja.
Provjerite što alternativa doista sadrži
Alternativna metoda bojenja i dalje može sadržavati metilensko plavilo. Giemsa je primjer: Merck svoj proizvod opisuje kao otopinu azure-eozin-metilenskog plavila, namijenjenu primjenama koje uključuju razmaze krvi i koštane srži. To može biti druga metoda za drugi uzorak, ali ne zadovoljava zahtjev za isključivanje metilenskog plavila.
Ako je isključivanje određenog spoja dio eksperimenta, prije usporedbe slika provjerite identitet i formulaciju reagensa. Vodič o metilnom plavilu, metilenskom plavilu i bojilima sličnih naziva objašnjava razlike u nazivlju.
Provjerite zamjenu prije uporabe rezultata
Za novu metodu napravite malu usporedbu na reprezentativnim uzorcima i s odgovarajućom kontrolom. Gdje je moguće, održavajte postavke mikroskopa usporedivima. Zabilježite formulaciju reagensa, pripremu uzorka, izloženost i uvjete snimanja kako bi se razlog bolje izgledajuće slike mogao istražiti, a ne samo preferirati.
Uspješnost procjenjujte prema izvornom pitanju. Za morfologiju procijenite jesu li granice i raspored stanica i dalje jasno protumačivi. Za označavanje jezgri procijenite položaj signala i pozadinu. Za vijabilnost zahtijevajte dokaze koji nadilaze privlačno razdvajanje boja. Širi vodič o bojenju metilenskim plavilom i laboratorijskim primjenama objašnjava kako su opažanje i priprema međusobno povezani.
Odaberite alternativu koja očuvava mjerenje koje vam je potrebno. Boja je samo jedno svojstvo dobivene slike.