न्यू मेथिलीन ब्लू और रेटिकुलोसाइट रंजन: एक अलग रंजक और जीवित कोशिकाओं की विधि

एक छात्र रेटिकुलोसाइट की गणना की तैयारी करता है, मेथिलीन ब्लू मंगाता है, उसे रक्त में मिलाता है और लगभग कुछ भी नहीं देख पाता। उसका सहपाठी न्यू मेथिलीन ब्लू लेबल वाली बोतल इस्तेमाल करता है और कुछ लाल रक्त कोशिकाओं के भीतर स्पष्ट नीले तंतु देखता है। पहला छात्र मान लेता है कि दूसरी बोतल का रंजक अधिक ताज़ा या अधिक सांद्र है। दोनों में से कोई बात सही नहीं है। उसमें एक अलग अणु है।

इस क्षेत्र में अधिकांश भ्रम के पीछे यही अवधारणात्मक गलती है। नाम से लगता है कि न्यू मेथिलीन ब्लू, मेथिलीन ब्लू का बेहतर बैच है। रसायन विज्ञान कुछ और बताता है। न्यू मेथिलीन ब्लू N एक अलग फेनोथियाज़ीन रंजक है, जिसकी अपनी Colour Index संख्या, अपना प्रतिस्थापन पैटर्न और रक्तविज्ञान में अपनी मानकीकृत भूमिका है। यह अंतर स्पष्ट हो जाने पर विधि के बाकी पहलू भी आसानी से समझ आते हैं: रंजन के समय कोशिकाओं का जीवित होना क्यों आवश्यक है, किसे रेटिकुलोसाइट माना जाता है, हाइन्ज़ बॉडी की इसमें क्या भूमिका है और ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू कब उपयोग में आता है।

संक्षिप्त उत्तर

रक्तविज्ञान में प्रयुक्त अभिकर्मक न्यू मेथिलीन ब्लू N को आम तौर पर न्यू मेथिलीन ब्लू के PubChem रिकॉर्ड में Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, सूत्र C18H22ClN3S के रूप में पहचाना जाता है। सामान्य मेथिलीन ब्लू, उसके PubChem रिकॉर्ड में मेथिलथायोनिनियम क्लोराइड, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, सूत्र C16H18ClN3S है। संरचना की दृष्टि से, न्यू मेथिलीन ब्लू में वलय पर दो मिथाइल समूह और एथिलअमीनो पार्श्व शृंखलाएँ होती हैं, जबकि मेथिलीन ब्लू में डाइमेथिलअमीनो समूह होते हैं। यह अंतर रंजन के व्यवहार को बदल देता है। रक्तविज्ञान की पाठ्यपुस्तकें सामान्य मेथिलीन ब्लू को रेटिकुलोसाइट के लिए अपेक्षाकृत कम प्रभावी रंजक और न्यू मेथिलीन ब्लू को अधिक गहरा और समान रंजन देने वाला बताती हैं। इस तुलना का सार न्यू मेथिलीन ब्लू पर ScienceDirect के विषय पृष्ठ में दिया गया है।

हाँ, न्यू मेथिलीन ब्लू एक सुप्रावाइटल रंजक है। सुप्रावाइटल रंजन का अर्थ शरीर से निकालने के बाद और स्थिरीकरण से पहले जीवित कोशिकाओं का रंजन करना है, जैसा कि सुप्रावाइटल रंजन के सिद्धांतों की NCBI समीक्षा में परिभाषित है। न्यू मेथिलीन ब्लू और ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू, दोनों इस श्रेणी में आते हैं, और CLSI रेटिकुलोसाइट मानक स्पष्ट रूप से न्यू मेथिलीन ब्लू को सुप्रावाइटल रंजक के रूप में शामिल करता है। छात्र कभी-कभी इसे स्थिरीकृत फिल्मों के रोमानोव्स्की रंजन जैसा समझ लेते हैं। यहाँ यह सोच काम नहीं करती। पहले स्थिरीकरण कर दें, तो विधि काम करना बंद कर देती है।

मिलते-जुलते रंजकों के नाम समझने वाले पाठकों के लिए, मिथाइल ब्लू बनाम मेथिलीन ब्लू ऋणायनिक ट्राइएरिलमेथेन रंजक और धनायनिक फेनोथियाज़ीन परिवार के बीच एक अलग और व्यापक भ्रम को स्पष्ट करता है। प्रयोगशाला रंजन का अवलोकन सुप्रावाइटल कार्य को स्थिरीकृत फिल्म विधियों के संदर्भ में रखता है, और रक्त कोशिका आकारिकी मार्गदर्शिका बताती है कि व्यापक विभेदक गणना में रेटिकुलोसाइट आकलन कहाँ आता है।

कैटलॉग से जुड़ी एक सावधानी: न्यू मेथिलीन ब्लू का एक अलग ज़िंक क्लोराइड द्विलवण रूप भी है, जिसका CAS 6586-05-6 है। इसलिए विधि अनुभाग में केवल सामान्य नाम नहीं, बल्कि लवण का रूप और आपूर्तिकर्ता भी बताया जाना चाहिए।

सुप्रावाइटल रंजन वास्तव में क्या करता है

रेटिकुलोसाइट एक युवा लाल रक्त कोशिका है, जिसका केंद्रक निकल चुका होता है लेकिन उसमें अवशिष्ट राइबोसोमल RNA बना रहता है। बिना रंजन वाली गीली तैयारी में यह RNA दिखाई नहीं देता। सुप्रावाइटल रंजक जीवित कोशिका में प्रवेश करता है और उस RNA को अवक्षेपित या एकत्रित करके नीले कणों और तंतुओं में बदल देता है। यही जालिकीय-तंतुमय पदार्थ तेल निमज्जन में दिखाई देता है। इसलिए यह जाल रंजन से बना उत्पाद है, रंग की प्रतीक्षा कर रहा कोई पहले से बना ढाँचा नहीं। इसी कारण प्रोटोकॉल के चर—रंजक की सांद्रता, बफर, रक्त और रंजक का अनुपात, तापमान और समय—रंजक के नाम जितने ही महत्वपूर्ण हैं।

व्यावहारिक रूप से इसका अर्थ है कि चरणों का क्रम सख्ती से बनाए रखना चाहिए: पहले थक्कारोधी युक्त रक्त को रंजक के साथ मिलाएँ, इन्क्यूबेट करें, फिर फिल्में बनाएँ और बिना स्थिरीकरण तथा बिना प्रतिरंजन के उनका परीक्षण करें। रंजन से पहले स्थिरीकरण, या हल्के तंतुओं को ढक देने वाला प्रतिरंजन, उस जानकारी को नष्ट कर देता है जिस पर गणना निर्भर करती है।

न्यू मेथिलीन ब्लू से रेटिकुलोसाइट का एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल

कोई एक सार्वभौमिक संरूपण नहीं है, इसलिए जो इस्तेमाल किया गया हो उसे दर्ज करें। तीन प्रलेखित विकल्प इस विविधता को दिखाते हैं।

पारंपरिक ब्रेकर-प्रकार की प्रक्रिया में पोटैशियम ऑक्सालेट के साथ लगभग 0.5 प्रतिशत न्यू मेथिलीन ब्लू इस्तेमाल किया जाता है। इसे अच्छी तरह मिश्रित EDTA रक्त के बराबर आयतन में मिलाकर कमरे के तापमान पर लगभग 10 से 15 मिनट इन्क्यूबेट किया जाता है। हल्के हाथ से दोबारा मिलाने के बाद पतली पच्चराकार फिल्में तैयार की जाती हैं, हवा में सुखाई जाती हैं और बिना स्थिरीकरण के 100x तेल-निमज्जन ऑब्जेक्टिव के नीचे देखी जाती हैं। रेटिकुलोसाइट गणना की NCBI प्रक्रिया इस कार्यप्रवाह और इसके साथ प्रयुक्त गणना फ्रेम का वर्णन करती है।

डेसी और लुईस विकल्प में साइट्रेट सलाइन में 1.0 प्रतिशत न्यू मेथिलीन ब्लू इस्तेमाल किया जाता है। इसे रक्त के 2 से 4 आयतन के साथ मिलाकर फिल्म बनाने से पहले 37 C पर 15 से 20 मिनट रखा जाता है। CLSI H44 प्रक्रिया के एक हालिया सामंजस्यीकरण कार्यान्वयन में pH 7.4 वाले फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन में कम सांद्रता वाला 0.1 प्रतिशत घोल इस्तेमाल किया गया, जिसे 20 C पर 10 मिनट इन्क्यूबेट किया गया और कोई स्थिरीकरण नहीं किया गया। यह 2026 के NMB सामंजस्यीकरण अध्ययन में बताया गया है।

सभी विकल्पों में गणना के नियम समान हैं। किसी कोशिका को रेटिकुलोसाइट तभी गिनें जब उसमें नीले रंजन वाले कम-से-कम दो अलग कण या तंतु-खंड हों; इससे अकेले रंजक जमाव को बाहर रखा जाता है। नियमित कार्य में कम-से-कम 1,000 लाल रक्त कोशिकाएँ गिनें और रेटिकुलोसाइट को प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट करें। कम प्रतिशत पर सांख्यिकीय दृष्टि से अधिक कोशिकाएँ गिनना आवश्यक होता है। CLSI H44 पद्धति की एक समीक्षा में बताया गया है कि लगभग 1 प्रतिशत रेटिकुलोसाइट होने पर गणना की परिवर्तनशीलता को 5 प्रतिशत तक लाने के लिए लगभग 4,400 कोशिकाएँ आवश्यक होती हैं; यह De Gruyter पर CLSI H44 समीक्षा में दिया गया है। मिलर ऑक्युलर डिस्क बड़ी संख्या में कोशिकाएँ गिनना व्यावहारिक बनाती है। रंजक को छानें या ताज़ा तैयार करें, क्योंकि अवक्षेप कणिकीय अंतर्वेशों जैसा दिख सकता है।

उसी तैयारी में हाइन्ज़ बॉडी

उसी सुप्रावाइटल फिल्म में हाइन्ज़ बॉडी भी दिखाई दे सकती हैं। ये अवशिष्ट RNA नहीं, बल्कि ऑक्सीकृत और विकृत हीमोग्लोबिन के समुच्चय होते हैं। न्यू मेथिलीन ब्लू की तैयारियों में ये गोल पिंडों की तरह दिखाई देते हैं, अक्सर एकल और झिल्ली के पास, तथा जालिकीय-तंतुमय पदार्थ से हल्के नीले रंग में रंजित होते हैं। स्थिरीकरण और प्रतिरंजन के दौरान ये अच्छी तरह नहीं टिकते, इसलिए बिना स्थिरीकरण वाली फिल्म की जाँच करें। 20 माइक्रोलीटर EDTA रक्त के साथ 1 प्रतिशत न्यू मेथिलीन ब्लू के 20 माइक्रोलीटर और 15 मिनट के इन्क्यूबेशन का उपयोग करने वाले एक हालिया प्रोटोकॉल में 250 एरिथ्रोसाइटों के बीच हाइन्ज़ बॉडी-पॉज़िटिव कोशिकाओं की गणना की गई। यह उस प्रक्रिया को बताने वाले PMC अध्ययन में वर्णित है।

दो अंतर गलत व्याख्या से बचाते हैं। पहला, मिथाइल वायलेट और क्रिस्टल वायलेट, न्यू मेथिलीन ब्लू की तुलना में हाइन्ज़ बॉडी को अधिक गहराई से रंजित करते हैं, जैसा कि ScienceDirect के हाइन्ज़ बॉडी विषय पृष्ठ में बताया गया है। जब रेटिकुलोसाइट और हाइन्ज़ बॉडी का आकलन साथ किया जाता है, तब न्यू मेथिलीन ब्लू सुविधाजनक विकल्प है; यह विशेष रूप से हाइन्ज़ बॉडी के लिए सबसे तीव्र रंजक नहीं है। दूसरा, अल्फा थैलेसीमिया ट्रेट में HbH अंतर्वेश सुप्रावाइटल रंजन के बाद पूरी कोशिका में अनेक बारीक बिंदुओं के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि पारंपरिक हाइन्ज़ बॉडी संख्या में कम, आकार में बड़ी और अक्सर झिल्ली से जुड़ी होती हैं। रंजक जमाव तीसरी मिलती-जुलती चीज़ है: यह कोशिकाओं के फोकल तल के बाहर होता है और अलग-अलग दृश्य क्षेत्रों में बदलता है।

ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू बनाम न्यू मेथिलीन ब्लू

दोनों रंजक रेटिकुलोसाइट के लिए सुप्रावाइटल रंजक हैं, लेकिन मानकीकरण इनमें से एक को प्राथमिकता देता है। CLSI H44-A2 रेटिकुलोसाइट विधि, जिसे इंटरनेशनल काउंसिल फॉर स्टैंडर्डाइज़ेशन इन हीमैटोलॉजी के साथ मिलकर विकसित किया गया और CLSI H44 मानक पृष्ठ पर सूचीबद्ध किया गया है, EDTA रक्त के न्यू मेथिलीन ब्लू रंजन को मैनुअल तुलनात्मक विधि के रूप में निर्धारित करती है। पारंपरिक रक्तविज्ञान शिक्षण भी दृश्य स्वरूप पर सहमत है: न्यू मेथिलीन ब्लू तंतुओं को अधिक गहरा और समान रूप से रंजित करता है, जबकि ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू में बैचों और नमूनों के बीच अधिक अंतर होता है।

इस स्थिति को एक स्पष्टीकरण के साथ समझना चाहिए। ICSH विश्लेषक मूल्यांकन दिशानिर्देश मैनुअल न्यू मेथिलीन ब्लू सूक्ष्मदर्शिकी को संदर्भ तुलना के तरीके के रूप में स्वीकार करता है, लेकिन इसे व्यक्तिपरक और अपेक्षाकृत कम परिशुद्ध बताता है। जहाँ उपलब्ध हों, वहाँ फ्लो साइटोमेट्रिक संदर्भ प्रक्रियाओं को प्राथमिकता दी जाती है। 100 नमूनों की 2022 की एक तुलना में इस्तेमाल किए गए विश्लेषक के सापेक्ष न्यू मेथिलीन ब्लू की तुलना में ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू के साथ कम व्यवस्थित विचलन मिला। यह रंजन विधियों की PMC तुलना में बताया गया है। छात्रों के लिए प्रमाणों पर आधारित सार यह है: न्यू मेथिलीन ब्लू को मानकीकृत मैनुअल तुलनात्मक मानक के रूप में इस्तेमाल करें, किसी भी स्थानीय ब्रिलियंट क्रेसिल ब्लू विधि का सत्यापन इसके या स्वचालित विधि के विरुद्ध करें, और दोनों ही स्थितियों में मैनुअल सूक्ष्मदर्शिकी से परिणामों में अधिक फैलाव की अपेक्षा रखें। पुराने मानकीकरण साहित्य में भी शुद्ध Azure B को रासायनिक रूप से अधिक शुद्ध विकल्प बताया गया था, क्योंकि व्यावसायिक रंजक बैचों में अंतर होता था। यह Azure B पर मार्शल अध्ययन में दिया गया है और समझाता है कि विधियों की चर्चा में अभिकर्मक का ग्रेड अब भी क्यों आता है।

आम गलतियों से बचना

अधिकांश असफल तैयारियों के पीछे चार गलतियाँ होती हैं। न्यू मेथिलीन ब्लू N की जगह सामान्य मेथिलीन ब्लू मंगाने से कमजोर रंजन होता है, जिसका कारण रसायन है, तकनीक नहीं। अवलोकन से पहले स्थिरीकरण या प्रतिरंजन करने से सुप्रावाइटल संकेत हट जाता है। रंजक अवक्षेप को कण मानकर गिनने से परिणाम बढ़ जाता है; दो कणों का नियम और छना हुआ रंजक इसे रोकते हैं। रेटिकुलोसाइट का प्रतिशत कम होने पर बहुत कम कोशिकाएँ गिनने से संख्या परिशुद्ध दिखती है, लेकिन उसकी विश्वास सीमाएँ चौड़ी होती हैं। हर गलती का संकेत एक जैसा है: सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने वाला व्यक्ति उस परिणाम के लिए सूक्ष्मदर्शी को दोष देता है, जो अभिकर्मक वाले चरण में ही तय हो चुका था।