मेथिलीन ब्लू से गाल की कोशिकाओं का अभिरंजन: क्या देखें

एक छात्रा स्लाइड पर गाल की कोशिकाओं के निलंबन की एक बूँद रखती है, सूक्ष्मदर्शी से देखती है और उसे लगभग कुछ भी दिखाई नहीं देता। उज्ज्वल दृश्य-क्षेत्र में कुछ फीकी छायाएँ तैरती दिखती हैं। वह फोकस समायोजित करती है, फिर प्रकाश बढ़ाती है और अंत में मान लेती है कि स्लाइड खाली है। स्लाइड खाली नहीं है। कोशिकाएँ वहीं हैं। वे लगभग पारदर्शी हैं, और यही पारदर्शिता वह समस्या है जिसे हल करने के लिए इस अभिरंजन का उपयोग किया जाता है।

प्रयोग विधि शुरू करने से पहले अपेक्षा और दिखाई देने वाली छवि के इस अंतर को स्पष्ट करना उपयोगी है। शुरुआती विद्यार्थी अपेक्षा करते हैं कि सूक्ष्मदर्शी बारीकियाँ उसी तरह दिखाएगा जैसे कैमरे का ज़ूम दूर के किसी संकेत-पट्ट को स्पष्ट कर देता है। ब्राइट-फील्ड सूक्ष्मदर्शी का काम अधिक सीमित है: वह प्रकाश के अवशोषण में अंतर दिखाता है। बिना अभिरंजित गाल की कोशिका लगभग कोई प्रकाश अवशोषित नहीं करती, इसलिए वह लगभग कोई अंतर उत्पन्न नहीं करती। मेथिलीन ब्लू यह अंतर पैदा करता है। यह कोशिका के भीतर असमान रूप से बँधता है और उसकी संरचना को दृश्य-विषमता में बदल देता है। जब विद्यार्थी यह अवधारणा समझ लेते हैं, तो आगे का हर चरण केवल निर्देश न रहकर उसके परिणाम के रूप में समझ आता है।

स्कूल की प्रयोगशाला में सरल अभिरंजन दृश्य-विषमता कैसे बढ़ाते हैं, इसकी पृष्ठभूमि यहाँ उपयोगी है। साथ ही, अभिरंजन से पहले ब्राइट-फील्ड सूक्ष्मदर्शी तैयार करने की पुनरावृत्ति आधी असफल स्लाइडों से बचाती है। इस रंग के पीछे का रसायन सूक्ष्मदर्शिकी में मेथिलीन ब्लू के परिचय में समझाया गया है, जहाँ बताया गया है कि यह विशेष रंजक प्रयोगशाला की मेज़ पर बार-बार क्यों दिखाई देता है।

कक्षा-प्रयोग विधि

नीचे दी गई आर्द्र माउंट विधि सामान्य कक्षाओं के लिए अधिक सरल मानक विकल्प है। इसमें लौ या स्थिरीकरण के किसी चरण की आवश्यकता नहीं होती। कुछ महाविद्यालयीय निर्देशिकाओं में प्रयुक्त स्थिर स्मीयर विधि में हवा में सुखाना और थोड़े समय के लिए ऊष्मा द्वारा स्थिरीकरण भी शामिल होता है, जैसा कि Biology LibreTexts पर प्रकाशित नॉर्थ सेंट्रल टेक्सस कॉलेज की गाल के स्मीयर की गतिविधि में है। लेकिन ऊष्मा द्वारा स्थिरीकरण सूक्ष्मजीवविज्ञान में प्रचलित प्रक्रिया है, उपकला कोशिकाओं को देखने के लिए अनिवार्य नहीं।

आवश्यक सामग्री: साफ़ स्लाइड और कवरस्लिप, निर्जीवाणुकृत एकल-उपयोग स्वैब (बेहतर विकल्प) या नई चपटी टूथपिक, 0.5 से 1 प्रतिशत जलीय मेथिलीन ब्लू की ड्रॉपर बोतल, आसुत या विआयनीकृत जल, सोख्ता कागज़, दस्ताने और 100x तथा 400x कुल आवर्धन वाला संयुक्त सूक्ष्मदर्शी।

1. सादे पानी से मुँह धोएँ। इससे भोजन के वे कण हट जाते हैं जो बाद में गहरा रंग पकड़कर कोशिकाओं से ध्यान भटकाते हैं।
2. प्रत्येक विद्यार्थी केवल अपने ही गाल का नमूना ले। नए निर्जीवाणुकृत स्वैब से गाल की अंदरूनी सतह को धीरे से रगड़ें। दबाएँ, खुरचें नहीं। असुविधा या रक्तस्राव होने से पहले ही रुक जाएँ।
3. स्वैब को साफ़ स्लाइड के बीच में घुमाते हुए पतली परत फैलाएँ। स्पष्ट रूप से देखी जा सकने वाली स्लाइड बनने की सबसे महत्वपूर्ण शर्त पतली परत है। मोटा सफ़ेद जमाव अभिरंजित होकर ऐसा नीला पिंड बन जाएगा जिसमें कुछ स्पष्ट नहीं दिखेगा।
4. स्मीयर पर मेथिलीन ब्लू की एक बूँद डालें। इसे 1 से 3 मिनट रहने दें। कई महाविद्यालयीय प्रयोग विधियों में एक मिनट पर्याप्त होता है; NCERT कक्षा IX की विज्ञान प्रयोगशाला निर्देशिका में अस्थायी माउंट के लिए लगभग 3 मिनट दिए गए हैं। अधिक समय देना बेहतर नहीं है, और अधिक अभिरंजन समय से जुड़ी सबसे आम गलती है।
5. स्थानीय प्रयोग विधि के अनुसार आसुत जल से धीरे से धोएँ या सोख्ता कागज़ से अतिरिक्त रंजक सोख लें। पृष्ठभूमि हल्की नीली होनी चाहिए, गहरी नीली नहीं।
6. कवरस्लिप को तिरछा नीचे लाएँ ताकि पहले उसका एक किनारा छुए, फिर उसे धीरे से नीचे आने दें। इससे हवा के बुलबुले भीतर नहीं फँसते।
7. कोशिकाएँ खोजने के लिए कम आवर्धन से शुरू करें, फोकस और केंद्र में उनकी स्थिति की पुष्टि करें, फिर 100x और अंत में 400x पर जाएँ। 400x पर केवल सूक्ष्म फोकस समायोजन का उपयोग करें।

रंजक की सांद्रता के बारे में एक बात स्पष्ट करना आवश्यक है। स्कूलों की प्रयोग विधियों में आम तौर पर लगभग 1 प्रतिशत जलीय मेथिलीन ब्लू उपयोग किया जाता है। अधिक सांद्र मूल विलयन या अधिक समय तक संपर्क से केंद्रक की तुलना में पृष्ठभूमि का रंग अधिक तेज़ी से गहरा होता है। इससे वह दृश्य-विषमता उलट जाती है जिस पर यह अभ्यास निर्भर करता है।

गाल के नमूने का सुरक्षित प्रबंधन

गाल के नमूनों के साथ लार और मुँह के सामान्य सूक्ष्मजीव भी आते हैं। इसलिए हर ताज़े स्मीयर को संभावित संक्रामक सामग्री मानें, भले ही नमूना देने वाले स्वस्थ सहपाठी हों। शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए अमेरिकन सोसाइटी फॉर माइक्रोबायोलॉजी के जैवसुरक्षा दिशानिर्देश सामान्य सिद्धांत बताते हैं: सत्र से पहले जोखिम का आकलन करें, दस्ताने पहनें, जहाँ छींटे पड़ सकते हों वहाँ आँखों की सुरक्षा करें, बाद में हाथ धोएँ, प्रयोगशाला की मेज़ों को विसंक्रमित करें और दूषित एकल-उपयोग सामग्री का निपटान स्वीकृत जैविक अपशिष्ट व्यवस्था से करें।

कक्षा के चार नियम अधिकांश जोखिम नियंत्रित करते हैं। प्रत्येक स्वैब और स्लाइड केवल एक नमूना-दाता के लिए हों, इन्हें कभी साझा न करें। केवल अपना नमूना लें, किसी सहपाठी का नहीं। एकल-उपयोग स्वैब और टूथपिक सीधे निर्धारित अपशिष्ट पात्र में डालें, वापस मेज़ पर कभी न रखें। मेथिलीन ब्लू स्वयं त्वचा और कपड़ों पर दाग छोड़ता है और आँखों में जलन पैदा करता है, इसलिए दस्ताने और रंजकों के उपयोग से जुड़ी सामान्य स्वच्छता आवश्यक हैं। इस अभ्यास को बढ़ाकर स्मीयर से किसी भी जीव का संवर्धन न करें, और स्कूल की सुरक्षा प्रक्रिया से बाहर ताज़ी मानव सामग्री का ऊष्मा द्वारा स्थिरीकरण अपने ढंग से न करें।

क्या देखें, और वह ऐसा क्यों दिखता है

100x पर चौड़ी, चपटी, हल्की नीली कोशिकाएँ खोजें, जिनकी बाहरी रूपरेखा अनियमित अंडाकार या बहुभुजी होती है। वे अकेली या ढीली, एक-दूसरे पर चढ़ी हुई परतों में दिखती हैं। प्रत्येक कोशिका में आम तौर पर एक अधिक गहरा नीला धब्बा होता है। यह धब्बा केंद्रक है। उनकी व्यवस्था पर भी ध्यान दें: शल्की उपकला कोशिकाएँ पतली टाइलों जैसी होती हैं, गोलों जैसी नहीं। इसी कारण उनके किनारे गोल गुब्बारों के बजाय दरकी हुई चमकदार सतह जैसे दिखते हैं।

400x पर तीन विशेषताएँ स्पष्ट दिखाई देती हैं। कोशिका की सीमा उसके चारों ओर एक पतली, अधिक गहरी रेखा के रूप में दिखती है। कोशिकाद्रव्य अंदर के हिस्से को हल्के, एकसमान नीले रंग से भरता है। केंद्रक अधिक गहरा और सघन दिखाई देता है, अक्सर अंडाकार होता है और सामान्यतः केंद्र के पास होता है, लेकिन हमेशा नहीं। विद्यार्थियों से इन तीनों के साथ कोशिका का आकार और आवर्धन भी दर्ज करने को कहें, क्योंकि कार्यपत्रिका में यही जानकारी माँगी गई है।

यहाँ सटीकता से जुड़ी एक बात महत्वपूर्ण है, जिसे कई कार्यपत्रिकाएँ गलत बताती हैं। दिखाई देने वाली सीमा प्लाज़्मा झिल्ली के क्षेत्र के अनुरूप है, लेकिन स्वयं झिल्ली, जो लगभग 7 से 10 नैनोमीटर मोटी लिपिड की द्विपरत है, स्कूल के सूक्ष्मदर्शी की विभेदन क्षमता से बहुत नीचे है। विद्यार्थियों को कोशिका का प्रकाशीय किनारा और वहाँ जमा रंजक दिखाई देता है। कोशिकांगों के बारे में भी यही सावधानी लागू होती है। इस तैयारी में माइटोकॉन्ड्रिया, अंतःप्रद्रव्यी जालिका, गॉल्जी काय और राइबोसोम दिखाई नहीं देते। जैसा कि सूक्ष्मदर्शिकी उपकरणों पर NCBI की कोशिका जीवविज्ञान संबंधी पृष्ठभूमि में समझाया गया है, अच्छी परिस्थितियों में पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी लगभग 0.2 माइक्रोमीटर तक की बारीकियों में भेद कर सकता है, और अधिकांश अतिसूक्ष्म संरचनाएँ इस सीमा से नीचे या इसके पास होती हैं। अधिक रिक्त आवर्धन छवि को बड़ा तो करता है, लेकिन उसमें नई बारीकियाँ नहीं जोड़ता।

केंद्रक सबसे गहरा रंग क्यों पकड़ता है? मेथिलीन ब्लू एक धनायनिक रंजक है, जो विलयन में धनावेशित होता है और कोशिका में ऋणावेशित सामग्री, विशेषकर न्यूक्लिक अम्लों, से जुड़ता है। क्रोमैटिन केंद्रक में DNA को केंद्रित करता है, इसलिए केंद्रक सबसे अधिक रंजक एकत्र करता है। कोशिकाद्रव्य में RNA और अन्य आवेशित अणु होते हैं, इसलिए वह भी रंग पकड़ता है, लेकिन अधिक फैले हुए और हल्के रूप में। महत्वपूर्ण सीमा यह है: मेथिलीन ब्लू DNA-विशिष्ट रंजक नहीं है। केंद्रक की छवि बनाने में मेथिलीन ब्लू के वितरण पर किए गए शोध में धनायन के न्यूक्लिक अम्लों से समृद्ध क्षेत्रों के साथ जुड़ने का वर्णन है। वहीं, कोशिका तैयारियों में मेथिलीन ब्लू के बंधन पर पुराने मात्रात्मक शोध में पाया गया कि अधिकांश बँधा हुआ रंजक न्यूक्लिक अम्लों से जुड़ा था। इसलिए गहरे केंद्रक और हल्के कोशिकाद्रव्य का संयोजन दृश्य-विषमता का एक पैटर्न है, कोई आणविक परीक्षण नहीं।

विद्यार्थियों की संभावित गलतियाँ और उन्हें कैसे पहचानें

लगभग हर असफल स्लाइड पाँच प्रकार के पैटर्न में से किसी एक में आती है। विद्यार्थियों को बिना सोचे प्रयोग दोहराने के बजाय स्लाइड की समस्या पहचानना सिखाएँ।

अधिक अभिरंजन कोशिकाओं और पृष्ठभूमि को एकसमान गहरा कर देता है, जिससे केंद्रक दृश्य-क्षेत्र में खो जाता है। इसे ठीक करने के लिए अभिरंजन का समय घटाएँ या अधिक अच्छी तरह धोएँ। कम अभिरंजन से फीकी छायाएँ बचती हैं जो प्रकाश बढ़ाने पर गायब हो जाती हैं; समय को तीस-तीस सेकंड के चरणों में बढ़ाएँ। मोटे स्मीयर घने, एक-दूसरे पर चढ़े हुए पिंड बनाते हैं जिनमें किसी कोशिका की रूपरेखा नहीं पहचानी जा सकती; इसका सुधार फैलाने की प्रक्रिया में है—अगली बार अधिक पतली परत बनाएँ, क्योंकि किसी भी तरह धोने से कोशिकाओं का ढेर ठीक नहीं होगा। हवा के बुलबुले तीखे, गहरे किनारों वाले बिल्कुल गोल वृत्तों जैसे दिखते हैं और शुरुआती विद्यार्थियों का ध्यान भटकाते हैं, जो उन्हें कोशिका की संरचनाएँ समझ लेते हैं; कवरस्लिप को फिर से तिरछा रखते हुए धीरे से नीचे लाएँ। कोशिकाओं पर या उनके आसपास बिखरे छोटे गहरे बिंदु आम तौर पर मुँह के सामान्य जीवाणु होते हैं, जैसा कि Ingrid Science की गाल की कोशिकाओं की प्रयोग विधि जैसी स्कूल की प्रयोग विधियाँ बताती हैं। वे पुष्टि करते हैं कि मुँह में जीव रहते हैं, जो विद्यार्थियों को याद रह सकता है, लेकिन इस अभ्यास में उनकी प्रजाति की पहचान नहीं की जा सकती और उन्हें कोशिका के हिस्सों के रूप में नहीं बनाना चाहिए। भोजन के अवशेष और श्लेष्मा के तंतु अनियमित और गहरा रंग पकड़ते हैं; पहले मुँह धोने का उद्देश्य इन्हें कम करना है।

इस अभ्यास से क्या नहीं किया जा सकता

यह एक शैक्षिक अवलोकन है, निदान संबंधी परीक्षण नहीं। कक्षा में किए गए अभिरंजन में कोशिकाओं का रूप देखकर संक्रमण, कैंसर या किसी भी बीमारी का निदान नहीं किया जा सकता, और इस लेख को ऐसा सुझाव देने वाला नहीं समझना चाहिए। यह तैयारी दो आवर्धनों पर आकार, सीमा, कोशिकाद्रव्य और केंद्रक दिखाती है। यह झिल्ली की अतिसूक्ष्म संरचना, कोशिकांगों की बारीकियाँ या आणविक पहचान नहीं दिखाती। सीमा को स्पष्ट रूप से बताना विज्ञान और विद्यार्थियों, दोनों की रक्षा करता है: अच्छा परिणाम वह सही ढंग से नामांकित चित्र है जिसमें आवर्धन और रंजक दर्ज हों, न कि स्वास्थ्य के बारे में कोई निष्कर्ष।

विद्यार्थियों की कार्यपत्रिका और नामांकित सूक्ष्मचित्र

इस पृष्ठ की दो परियोजना-सामग्रियाँ ऊपर दिया गया नामांकित सूक्ष्मचित्र और नीचे दी गई कार्यपत्रिका हैं। प्रत्येक विद्यार्थी के लिए कार्यपत्रिका की एक प्रति छापें या उसे प्रक्षेपित करें और विद्यार्थियों से उसके खानों को अपनी नोटबुक में बनाने को कहें।

45 मिनट के सत्र में इसका उपयोग कैसे करें: सुरक्षा निर्देश और नमूना लेने के लिए दस मिनट, अभिरंजन और माउंट बनाने के लिए दस मिनट, दोनों आवर्धनों पर अवलोकन और रेखाचित्र बनाने के लिए पंद्रह मिनट, तथा जाँच-सूची और नामांकित सूक्ष्मचित्र से तुलना के लिए दस मिनट। जाँच-सूची के बिंदु जानबूझकर सीधे और प्रक्रियात्मक रखे गए हैं। पतला स्मीयर, सही अभिरंजन समय, कोशिकाद्रव्य से गहरा केंद्रक और दर्ज किया गया आवर्धन। जो विद्यार्थी इन चारों की पुष्टि कर सकता है, उसने वह अवधारणा समझ ली है जिसे यह पाठ सिखाना चाहता है: सूक्ष्मदर्शी अंतर दिखाते हैं, और अभिरंजन वे अंतर उत्पन्न करते हैं जिन्हें दिखाना उपयोगी है।