मेथिलीन ब्लू से सरल अभिरंजन बनाम ग्राम अभिरंजन: हर विधि क्या सिद्ध कर सकती है

एक छात्र E. coli लेबल वाले कल्चर से स्मीयर तैयार करता है, उसे एक मिनट तक मेथिलीन ब्लू से ढकता है, धोता है और ऑयल इमर्शन लेंस से देखता है। दृश्य क्षेत्र में नीली छड़ाकार कोशिकाएँ फैली हैं। प्रयोगशाला की रिपोर्ट में लिखा है: "ग्राम-ऋणात्मक छड़ाकार जीवाणुओं की पहचान E. coli के रूप में हुई।" अवलोकन सही है। लेकिन उस स्लाइड से यह निष्कर्ष निकालना उचित नहीं है।

गलती तकनीकी नहीं, अवधारणात्मक है। छात्र ने सरल अभिरंजन को विभेदक परीक्षण मान लिया। सरल अभिरंजन और ग्राम अभिरंजन अलग-अलग प्रश्नों के उत्तर देते हैं, क्योंकि वे अभिरंजन की अलग-अलग अवधारणाओं पर आधारित हैं। पहला पूछता है: कौन-सा आकार मौजूद है। दूसरा पूछता है: परीक्षण की परिस्थितियों में कोशिका भित्ति कैसा व्यवहार करती है। दोनों में भ्रम होने पर सही ढंग से अभिरंजित स्लाइड भी एक आधारहीन रिपोर्ट का कारण बनती है।

यह तुलना दोनों विधियों को अलग रखती है, दिखाती है कि प्रत्येक परिणाम के आधार पर आप क्या दावा कर सकते हैं, और छात्रों के दो सबसे आम प्रश्नों के उत्तर देती है: क्या ग्राम अभिरंजन में मेथिलीन ब्लू का उपयोग किया जा सकता है, और E. coli का मेथिलीन ब्लू अभिरंजन वास्तव में क्या दिखाता है।

संक्षिप्त उत्तर

मेथिलीन ब्लू से सरल अभिरंजन हर अभिरंजित हो सकने वाली कोशिका को एक ही नीला रंग देता है। इसलिए यह आकारिकी (छड़ाकार, गोलाकार, सर्पिल) और व्यवस्था (अकेली, जोड़ों में, शृंखलाओं में) दिखाता है, लेकिन ग्राम श्रेणी के बारे में कुछ नहीं बताता। ग्राम अभिरंजन में आयोडीन, विरंजीकरण का चरण और एक प्रतिरंजक शामिल होते हैं। इसलिए यह जीवाणुओं को ग्राम-धनात्मक (बैंगनी) और ग्राम-ऋणात्मक (गुलाबी या लाल) में अलग करता है, इस आधार पर कि उनके कोशिका आवरण रंजक को कैसे बनाए रखते हैं। मेथिलीन ब्लू के बाद नीली छड़ाकार कोशिकाओं का अर्थ है, "छड़ाकार कोशिकाएँ मौजूद हैं।" पूरी ग्राम प्रक्रिया के बाद गुलाबी छड़ाकार कोशिकाओं का अर्थ है, "ग्राम-ऋणात्मक छड़ाकार जीवाणु मौजूद हैं।" दूसरा कथन अधिक ठोस है, क्योंकि प्रक्रिया में एक अतिरिक्त परीक्षण किया गया था।

जीवाणुओं के अभिरंजन की उन एक-रंजक विधियों के व्यापक समूह के लिए, जिसका यह लेख हिस्सा है, सूक्ष्मदर्शी अभिरंजन एटलस देखें।

सरल अभिरंजन: एक रंजक, एक प्रश्न

मेथिलीन ब्लू एक क्षारीय (धनायनिक) रंजक है। इसके रंगीन आयन पर धनात्मक आवेश होता है और यह कोशिका की ऋणात्मक आवेश वाली संरचनाओं से जुड़ता है, जिनमें न्यूक्लिक अम्ल और सतह के अम्लीय समूह शामिल हैं। इसलिए हल्की पृष्ठभूमि पर कोशिकाएँ नीली दिखाई देती हैं। OpenStax अपने अभिरंजन अध्याय में धनात्मक अभिरंजन के इस सिद्धांत का वर्णन करता है। रंजक का धनायन स्वयं एक छोटा, समतल फीनोथायज़ीन आयन है, जिसका विवरण मेथिलीन ब्लू रसायन विज्ञान संदर्भ में दिया गया है; क्लोराइड प्रतिआयन रंग नहीं देता।

एक मानक शिक्षण प्रोटोकॉल जानबूझकर सरल रखा जाता है: पतला स्मीयर बनाएँ, हवा में सुखाएँ, ऊष्मा से स्थिर करें, लगभग 1% जलीय मेथिलीन ब्लू से करीब एक मिनट तक ढकें, पानी से धीरे-धीरे धोएँ, सोखकर सुखाएँ और ऑयल इमर्शन से जाँचें। LibreTexts का एक शिक्षण प्रोटोकॉल ठीक यही 1% और एक मिनट वाली प्रक्रिया देता है, साथ ही यह बताता है कि कुछ प्रयोगशालाएँ समय बढ़ाती हैं। न कोई रंगबंधक, न विरंजक, न दूसरा रंजक। इनका न होना ही मुख्य बात है। केवल एक रंजक और उसे चुनिंदा ढंग से हटाने का कोई चरण न होने पर, रंजक से जुड़ने वाली हर कोशिका अंत में एक ही रंग की होती है।

E. coli के मामले में अपेक्षित दृश्य क्षेत्र में नीली छड़ाकार कोशिकाएँ (बैसिली) दिखती हैं, जो अकेली, जोड़ों में या छोटे समूहों में होती हैं। नीला रंग रंजक से आता है। छड़ाकार आकृति जीव की विशेषता है। लेकिन इन दोनों का मेल जीव की पहचान नहीं करता, क्योंकि अनेक प्रजातियाँ छड़ाकार होती हैं और अनेक छड़ाकार कोशिकाएँ सरल अभिरंजन में नीली हो जाती हैं। ATCC अपनी सूक्ष्मजीव विज्ञान कल्चर मार्गदर्शिका में स्पष्ट करता है कि यह केवल आकारिकी तक सीमित है। एक सही रिपोर्ट में लिखा होगा: "नीली छड़ाकार कोशिकाएँ देखी गईं।" आकार और व्यवस्था से आगे किसी भी निष्कर्ष के लिए अधिक साक्ष्य चाहिए।

ग्राम अभिरंजन: चार अभिकर्मक, व्यवहार का एक परीक्षण

ग्राम अभिरंजन एक विभेदक अभिरंजन है। इसमें सभी कोशिकाओं पर एक ही क्रम लागू किया जाता है और देखा जाता है कि कौन-सी कोशिकाएँ पहला रंजक बनाए रखती हैं और कौन-सी उसे खो देती हैं। American Society for Microbiology के ग्राम अभिरंजन प्रोटोकॉल मानक चार-चरणीय क्रम परिभाषित करते हैं: क्रिस्टल वायलेट (प्राथमिक रंजक), ग्राम आयोडीन (रंगबंधक), अल्कोहल या एसीटोन-अल्कोहल (विरंजक), और फिर सैफ्रानिन (प्रतिरंजक)।

मानक शिक्षण मॉडल इस अंतर को कोशिका आवरण की संरचना के आधार पर समझाता है। ग्राम-धनात्मक कोशिकाओं की पेप्टिडोग्लाइकैन भित्ति मोटी होती है, जो अल्कोहल से धोने के दौरान निर्जलित होकर क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन संकुल को बनाए रखती है। ग्राम-ऋणात्मक कोशिकाओं में पेप्टिडोग्लाइकैन की पतली परत और लिपिड-समृद्ध बाहरी झिल्ली होती है, जिसे विरंजक बाधित करता है। इसलिए संकुल धुलकर निकल जाता है और कोशिकाएँ फिर सैफ्रानिन ग्रहण करती हैं। NCBI Bookshelf की ग्राम अभिरंजन समीक्षा कोशिका भित्ति पर आधारित यह व्याख्या देती है। विशेषज्ञ यह भी बताते हैं कि इसका पूरा भौतिक रसायन केवल भित्ति की मोटाई से अधिक जटिल है, लेकिन प्रयोगशाला में परिणाम की व्याख्या के लिए व्यवहार का यह नियम लागू होता है: बैंगनी का अर्थ है रंजक बना रहा, गुलाबी का अर्थ है रंजक निकल गया और फिर प्रतिरंजन हुआ।

उदाहरणात्मक पैनल। विधियों की तुलना के लिए शैलीबद्ध चित्र, कैमरे से लिए गए सूक्ष्मदर्शी छायाचित्र नहीं। तर्क समझाने के लिए रंगों को सरल रखा गया है: सरल अभिरंजन में एक रंग, ग्राम विरंजीकरण के बाद दो रंग।

क्या ग्राम अभिरंजन में मेथिलीन ब्लू का उपयोग किया जा सकता है

इस प्रश्न के दो अर्थ हैं, और दोनों के उत्तर अलग हैं।

पहला अर्थ: क्या केवल एक बार मेथिलीन ब्लू से ढक देना पूरी ग्राम प्रक्रिया की जगह ले सकता है। नहीं। आयोडीन, विरंजक और प्रतिरंजक के बिना कोई विभेदक चरण नहीं होता, इसलिए किसी ग्राम श्रेणी का परीक्षण नहीं होता। केवल मेथिलीन ब्लू के बाद नीला दृश्य क्षेत्र सरल अभिरंजन का परिणाम है, भले ही उसकी बोतल ग्राम अभिकर्मकों के पास रखी हो। इसे ग्राम परिणाम के रूप में दर्ज न करें।

दूसरा अर्थ: क्या चरण 4 में प्रतिरंजक के रूप में मेथिलीन ब्लू सैफ्रानिन की जगह ले सकता है। कार्यात्मक रूप से यह विरंजित कोशिकाओं को रंग दे सकता है, और पाठ्यपुस्तक का एक अभ्यास बताता है कि इस बदलाव के बाद ग्राम-धनात्मक कोशिकाएँ बैंगनी और ग्राम-ऋणात्मक कोशिकाएँ नीली दिखेंगी। यह तर्क सही है, क्योंकि ठीक से विरंजित ग्राम-ऋणात्मक कोशिकाएँ लगभग रंगहीन होती हैं और दूसरा धनायनिक रंजक ग्रहण कर लेंगी। लेकिन यह मानक प्रोटोकॉल नहीं है। ASM प्रोटोकॉल सैफ्रानिन निर्दिष्ट करते हैं, और कुछ रूपांतरों में बेसिक फुक्सिन जैसे मान्य विकल्प होते हैं, मेथिलीन ब्लू नहीं। इसका एक व्यावहारिक नुकसान भी है: बैंगनी और नीले के बीच अंतर पहचानना, बैंगनी और गुलाबी के बीच अंतर पहचानने से कठिन है, खासकर शुरुआती लोगों के लिए और विशेष रूप से जब सूक्ष्मदर्शी के लैंप की रोशनी कमजोर हो। पाठ्यक्रम के काम और किसी भी महत्त्वपूर्ण परिणाम के लिए अपने प्रोटोकॉल में बताए गए प्रतिरंजक का उपयोग करें, जो आम तौर पर सैफ्रानिन होता है। मेथिलीन ब्लू प्रतिरंजक को समकक्ष मानक के बजाय प्रदर्शन के लिए एक रूपांतर मानें।

मेथिलीन ब्लू की अन्य एक-रंजक विकल्पों से तुलना का संबंधित प्रश्न सरल जीवाणु अभिरंजकों की तुलना में शामिल है।

E. coli का मेथिलीन ब्लू अभिरंजन क्या सिद्ध करता है और क्या नहीं

E. coli एक ग्राम-ऋणात्मक छड़ाकार जीवाणु है, लेकिन इस वाक्य में कई विधियों से प्राप्त तथ्य एक साथ हैं: सूक्ष्मदर्शी जाँच से आकारिकी, ग्राम अभिरंजन से ग्राम प्रतिक्रिया, और कल्चर के साथ जैवरासायनिक या आणविक परीक्षण से पहचान। मेथिलीन ब्लू स्मीयर केवल पहले हिस्से में योगदान देता है। यह स्थापित करता है कि अभिरंजित नमूने में छड़ाकार कोशिकाएँ मौजूद हैं और वे किस तरह व्यवस्थित हैं। यह ग्राम प्रतिक्रिया स्थापित नहीं करता, क्योंकि विरंजीकरण परीक्षण किया ही नहीं गया। यह प्रजाति की पहचान नहीं करता, क्योंकि इस विभेदन क्षमता पर अनेक प्रजातियों की छड़ाकार कोशिकाएँ एक जैसी दिखती हैं।

यहीं रिपोर्टों में एक अनुमानित ढंग से गलती होती है। लेखक पृष्ठभूमि की जानकारी ("यह कल्चर E. coli का होना चाहिए, और E. coli ग्राम-ऋणात्मक है") को अवलोकन वाली पंक्ति में शामिल कर देता है। इससे लगता है कि स्लाइड ने उस बात की पुष्टि कर दी है, जिसे वास्तव में मान लिया गया था। एक अधिक स्पष्ट रिपोर्ट इन स्तरों को अलग रखती है: "मेथिलीन ब्लू से सरल अभिरंजन: नीली छड़ाकार कोशिकाएँ देखी गईं; केवल आकारिकी, किसी ग्राम श्रेणी का परीक्षण नहीं किया गया।" फिर, यदि नियंत्रणों के साथ ग्राम अभिरंजन सही ढंग से किया गया हो: "ग्राम अभिरंजन: गुलाबी छड़ाकार कोशिकाएँ, ग्राम-ऋणात्मक परिणाम के अनुरूप।" प्रजाति की पहचान बाद में पहचान की कार्यप्रणाली से होती है, केवल रंग से नहीं।

व्याख्या के लिए एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका

प्रयोगशाला में यह निर्णय नियम अपनाएँ। यदि सभी कोशिकाएँ एक रंग की हैं और प्रोटोकॉल में बिना विरंजक के एक ही रंजक का उपयोग हुआ है, तो आपने सरल अभिरंजन किया है। आकार, अनुमानित माप और व्यवस्था की रिपोर्ट दें। वहीं रुकें। यदि प्रोटोकॉल में ज्ञात धनात्मक और ऋणात्मक नियंत्रणों के साथ क्रिस्टल वायलेट, आयोडीन, विरंजक और प्रतिरंजक का उपयोग हुआ है, तो आपने ग्राम अभिरंजन किया है। रंग के साथ आकारिकी की रिपोर्ट दें: शृंखलाओं में बैंगनी गोलाकार कोशिकाएँ, गुलाबी छड़ाकार कोशिकाएँ, इत्यादि।

अधिकांश भ्रम तीन गलतियों से पैदा होता है। पहली, नीली छड़ाकार कोशिकाओं को E. coli की पुष्टि मान लेना। दूसरी, नोटबुक में मेथिलीन ब्लू स्लाइड को "ग्राम अभिरंजन" शीर्षक के अंतर्गत दर्ज करना, जिसे बाद के पाठक गलत समझेंगे। तीसरी, बिना पर्याप्त विचार के प्रतिरंजक बदल देना और फिर अलग-अलग प्रयोगशालाओं के रंगों की तुलना ऐसे करना मानो उनकी रंग-योजनाएँ समान हों। हर गलती का सुधार एक ही है: वास्तव में की गई विधि का नाम लिखें और केवल उसी बात का दावा करें जिसका वह विधि परीक्षण करती है।

सरल अभिरंजन का महत्त्व ठीक इसी बात में है कि यह सीमित दावा करता है। यह तेज है, मामूली प्रक्रियागत चूकों को सह लेता है, और जब प्रश्न आकारिकी का हो तो पर्याप्त है: क्या वहाँ कुछ मौजूद है, और उसका आकार क्या है। जब प्रश्न वर्गीकरण का हो, तो विभेदक परीक्षण करें। नीली स्लाइड बताती है कि कोशिकाएँ कैसी दिखती हैं। बैंगनी या गुलाबी स्लाइड बताती है कि उनकी भित्तियाँ कैसा व्यवहार करती हैं। इनमें से कोई भी स्लाइड अकेले प्रजाति नहीं बताती।