मेथिलीन ब्लू प्रयोगों में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का मापन

दो प्रयोगशालाएँ ऐसे प्रयोग करती हैं जिन्हें वे मेथिलीन ब्लू का एंटीऑक्सीडेंट प्रयोग कहती हैं। एक बताती है कि यह रंगद्रव्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों को कम करता है। दूसरी बताती है कि यह उन्हें उत्पन्न करता है। दोनों स्पष्ट खुराक-प्रतिक्रिया वक्र दिखाती हैं। दोनों ईमानदारी से अपने निष्कर्ष प्रस्तुत करती हैं। अंतर धोखाधड़ी या अक्षमता का नहीं है। दोनों समूहों ने अलग-अलग प्रकाश परिस्थितियों में अलग-अलग चीज़ें मापीं, ऐसे प्रोब इस्तेमाल किए जो अलग-अलग प्रश्नों के उत्तर देते हैं, और फिर दोनों उत्तरों का वर्णन एक ही शब्द से किया: ROS।

मेथिलीन ब्लू का सटीक मापन कठिन है, क्योंकि यह उस रासायनिक प्रक्रिया में स्वयं भाग लेता है जिसका इसे निरीक्षण करना है। अंधेरे में यह दाताओं और ग्राही अणुओं के बीच इलेक्ट्रॉनों का परिवहन करता है और अपने प्रारंभिक रूप में लौट आता है, ताकि चक्र दोबारा चल सके। प्रकाश में यह प्रकाश-संवेदीकारक बन जाता है और उत्तेजित त्रिक अवस्था में पहुँचता है। इस अवस्था से यह ऑक्सीजन को ऊर्जा देकर सिंगलेट ऑक्सीजन बना सकता है, या इलेक्ट्रॉन स्थानांतरित करके मुक्त मूलक और हाइड्रोजन पेरॉक्साइड उत्पन्न कर सकता है। इस तंत्र में डाला गया कोई भी प्रोब स्वयं रंगद्रव्य के कारण ऑक्सीकृत, अपचयित या विरंजित हो सकता है, या उसका प्रकाशीय संकेत छिप सकता है। इसलिए किसी भी ROS मापन में पहला प्रश्न यह नहीं होता कि संख्या क्या है। पहला प्रश्न यह होता है कि परीक्षण वास्तव में क्या पता लगाता है, और रंगद्रव्य उस परीक्षण को कैसे प्रभावित करता है।

Amplex Red: एक अंशांकित हाइड्रोजन पेरॉक्साइड परीक्षण

सही ढंग से तैयार किए जाने पर, मेथिलीन ब्लू और Amplex Red का संयोजन इस साहित्य में सबसे ठोस आधार वाला संयोजन है। इसकी रासायनिक प्रक्रिया विशिष्ट है: हॉर्सरैडिश पेरॉक्सिडेज़ हाइड्रोजन पेरॉक्साइड का उपयोग करके Amplex सब्सट्रेट को प्रतिदीप्त उत्पाद, रेसोरुफिन, में ऑक्सीकृत करता है। इसमें स्टॉइकियोमेट्रिक अनुपात लगभग एक से एक होता है। नमूने का पेरॉक्साइड संसूचक में प्रतिदीप्ति के रूप में दिखाई देता है। ROS के प्रचलित समूह का कोई अन्य सदस्य इस अभिक्रिया को सीधे नहीं चलाता।

इसका निर्णायक लाभ अंशांकन है। सावधानीपूर्वक काम करने वाला शोधकर्ता उसी बफर में ज्ञात पेरॉक्साइड मानक चलाता है, जिसमें पेरॉक्सिडेज़ और सब्सट्रेट की सांद्रताएँ, ऊष्मायन समय और प्रकाशीय सेटिंग्स भी वही होती हैं। फिर वह नमूनों के परिणामों का आकलन उस वक्र के आधार पर करता है। इस विधि के आधारभूत अध्ययन में, जिसमें मस्तिष्क से पृथक किए गए माइटोकॉन्ड्रिया इस्तेमाल हुए थे, लेखकों ने ठीक यही किया। उन्होंने प्रत्येक परीक्षण के अंत में पेरॉक्साइड की ज्ञात मात्राएँ जोड़ीं, और परिणामों को मनमानी प्रतिदीप्ति इकाइयों के बजाय प्रति मिलीग्राम प्रोटीन प्रति मिनट पिकोमोल की दरों के रूप में प्रस्तुत किया। इसी से चमक एक मापन बनती है।

उस अध्ययन की तीन बातों को अपनाना चाहिए। पहली, लेखकों ने कैटालेज़ से संकेत की पुष्टि की, जो पेरॉक्साइड को नष्ट करता है। कैटालेज़ जोड़ने पर मेथिलीन ब्लू से उत्पन्न प्रतिदीप्ति की वृद्धि रुक गई। इससे पुष्टि हुई कि संकेत पेरॉक्साइड का था, किसी प्रकाशीय मापन-विकृति का नहीं। दूसरी, उन्होंने उत्तेजन किरण को शटर से नियंत्रित करके प्रकाश के प्रभाव का सीधे परीक्षण किया। नमूनों को सामान्य प्रकाश मात्रा का आठवाँ हिस्सा मिला, और संकेत केवल नौ प्रतिशत घटा। उनके द्वारा बताए गए पेरॉक्साइड का नब्बे प्रतिशत से अधिक मापन के प्रकाश से स्वतंत्र था। तीसरी, उन्होंने इलेक्ट्रोड से पेरॉक्साइड हटने की प्रक्रिया अलग से मापी और पाया कि रंगद्रव्य ने उसका उत्पादन बढ़ाने के साथ-साथ उसे हटाने की प्रक्रिया भी धीमी की। केवल शुद्ध प्रतिदीप्ति बताने वाला प्रोब इन दोनों प्रभावों को एक साथ मिला देता।

फिर भी यह परीक्षण कई तरह से विफल हो सकता है, और मेथिलीन ब्लू इनमें से कई स्थितियाँ पैदा करता है। रंगद्रव्य लाल वर्णक्रम के उसी क्षेत्र में व्यापक रूप से प्रकाश अवशोषित करता है जहाँ रेसोरुफिन उत्सर्जन करता है। इसलिए रंगद्रव्य की अधिक सांद्रता पर नमूना आंतरिक फ़िल्टर प्रभावों के कारण अपना ही संकेत छिपा सकता है। अतः मानकों में रंगद्रव्य की सांद्रता नमूनों के समान होनी चाहिए। Amplex Red स्वयं भी प्रकाश-ऑक्सीकरण से गुजर सकता है, और उसका उत्पाद रेसोरुफिन प्रकाश-रेडॉक्स चक्रण में भाग लेकर सुपरऑक्साइड और पेरॉक्साइड उत्पन्न कर सकता है। जब प्रयोग में किसी प्रकाश-संवेदीकारक को भी प्रकाशित किया जाता है, तब यह बात बहुत महत्त्वपूर्ण होती है। इसका व्यावहारिक समाधान है कि पहले मेथिलीन ब्लू के नमूनों को विकिरण दिया जाए और फिर उनके अंशों का परीक्षण अंधेरे में Amplex अभिकर्मकों से किया जाए, बजाय रंगद्रव्य और प्रोब को एक साथ प्रकाशित करने के। अंत में, सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज़ केवल Amplex संकेत को दबाता नहीं है: सुपरऑक्साइड को पेरॉक्साइड में बदलने से संकेत बढ़ सकता है। प्रतिदीप्ति बढ़ाने वाला SOD नियंत्रण विफल नहीं हुआ है। उसने सुपरऑक्साइड को प्रक्रिया के पहले चरण में मौजूद प्रजाति के रूप में पहचाना है।

DCFDA: एक अविशिष्ट ऑक्सीकरण सूचक

मेथिलीन ब्लू और DCFDA का संयोजन अधिकांश भ्रम का स्रोत है। DCFH-DA ऐसा पूर्वगामी यौगिक है जिसे कोशिकाओं में पहुँचाया जाता है। कोशिका के भीतर एस्टरेज़ इसके एसीटेट समूह हटा देते हैं, जिससे अप्रतिदीप्त DCFH बचता है। DCFH के ऑक्सीकरण से प्रतिदीप्त DCF बनता है। इसे ऑक्सीकृत करने वाले पदार्थों की सूची लंबी है: हाइड्रॉक्सिल मुक्त मूलक, पेरॉक्सिडेज़ और हीम के मध्यवर्ती यौगिक, नाइट्रोजन डाइऑक्साइड, हाइपोक्लोरस अम्ल और पेरॉक्सिनाइट्राइट से बने मुक्त मूलक। अकेला हाइड्रोजन पेरॉक्साइड इसे किसी उपयोगी दर पर सीधे ऑक्सीकृत नहीं करता। पेरॉक्साइड-निर्भर प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यतः प्रक्रिया में लौह, हीम प्रोटीन या पेरॉक्सिडेज़ की रासायनिक भूमिका आवश्यक होती है।

हर विधि अनुभाग में जिस आलोचनात्मक विश्लेषण का उल्लेख होना चाहिए, वह कल्याणरमन और सहकर्मियों द्वारा प्रोब के रूप में DCFH का विश्लेषण है। इसका सार मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया के उस अध्ययन में दिया गया है जिसने इसी कारण DCFDA को अस्वीकार किया था। इस विश्लेषण ने दिखाया कि यह प्रोब धीमी गति से अभिक्रिया करता है, उसका स्टॉइकियोमेट्रिक अनुपात निर्धारित नहीं है, उसका वैध अंशांकन नहीं है, और वह ROS के अलावा अन्य यौगिकों से भी अभिक्रिया करता है। प्रोब जो मापता है, उसे बढ़ाता भी है: DCFH का एक-इलेक्ट्रॉन ऑक्सीकरण DCF मुक्त मूलक बनाता है। यह ऑक्सीजन से अभिक्रिया करके सुपरऑक्साइड बनाता है, जो डिसम्यूटेशन से अतिरिक्त पेरॉक्साइड उत्पन्न करता है। इस तरह मापन जिस रासायनिक प्रक्रिया को दर्शाता है, उसका कुछ हिस्सा स्वयं उत्पन्न करता है।

इन बातों से DCFDA अनुपयोगी नहीं हो जाता। यह पहचान के बजाय प्रारंभिक जाँच का साधन बनता है। DCF प्रतिदीप्ति में वृद्धि का अर्थ है कि ऑक्सीकारक-निर्भर प्रोब ऑक्सीकरण बढ़ा। इसका अर्थ यह नहीं है कि पेरॉक्साइड बढ़ा, और निश्चित रूप से यह भी नहीं कि कुल ROS बढ़ा, क्योंकि कोई एक प्रोब इस मात्रा को नहीं मापता। मेथिलीन ब्लू पर पहले के शोध में, जो एक माइक्रोमोलर से अधिक सांद्रता पर DCF ऑक्सीकरण पर आधारित था, ऑक्सीकरण को बढ़ावा देने वाले प्रभाव बताए गए थे। उसी समय के अन्य तंत्रों में पेरॉक्साइड से प्रेरित कोशिका मृत्यु के विरुद्ध सुरक्षा बताई गई थी। अलग-अलग रेडॉक्स परिस्थितियों में उसी रंगद्रव्य के लिए दोनों अवलोकन सही हो सकते हैं, और अकेला DCF परिणाम यह नहीं बता सकता कि किस ऑक्सीकारक से संकेत आया। मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया पर पहले के अध्ययन का महत्त्व यह है कि उसने इस प्रारंभिक जाँच की जगह अंशांकित पेरॉक्साइड मापन अपनाया और पेरॉक्साइड का भार सीधे मापा: केवल एक सौ नैनोमोलर रंगद्रव्य ने भी परीक्षण किए गए प्रत्येक सब्सट्रेट और श्वसन अवस्था में पेरॉक्साइड के निकलने को कई गुना बढ़ा दिया।

DCFDA में मेथिलीन ब्लू से जुड़ी एक और समस्या है। रंगद्रव्य गहरे रंग का और रेडॉक्स-सक्रिय होता है, इसलिए यह प्रतिदीप्ति को विरंजित कर सकता है, उत्सर्जन को बुझा सकता है, या कोशिकीय ROS से स्वतंत्र रूप से प्रोब की रासायनिक प्रणाली को ऑक्सीकृत कर सकता है। रंगद्रव्य और प्रोब वाला, लेकिन कोशिकाओं से रहित नियंत्रण कोई वैकल्पिक औपचारिकता नहीं है। यही प्रयोग बताता है कि रंगद्रव्य प्रोब के साथ अंतःक्रिया करता है या नहीं।

स्पिन ट्रैपिंग और ऑक्सीजन खपत: पहचान और प्रवाह

जहाँ प्रतिदीप्त प्रोब यह बताते हैं कि कोई ऑक्सीकृत हो सकने वाला पदार्थ उत्पन्न हुआ, वहीं स्पिन ट्रैप के साथ इलेक्ट्रॉन स्पिन अनुनाद उस पदार्थ की पहचान के अधिक निकट पहुँचता है। मेथिलीन ब्लू की प्रकाश-रसायनिकी के एक प्रमुख अध्ययन में रंगद्रव्य, एस्कॉर्बेट और प्रकाश से बने एस्कॉर्बेट मुक्त मूलक का पता लगाने के लिए ESR का उपयोग किया गया। इसके बाद ऑक्सीजन खपत के प्रयोगों में पेरॉक्साइड निर्माण और स्पिन ट्रैपिंग प्रयोगों में लौह द्वारा उत्प्रेरित हाइड्रॉक्सिल मुक्त मूलक निर्माण दिखाया गया। प्रत्येक तकनीक ने वह प्रश्न हल किया जिसका उत्तर दूसरी तकनीकें नहीं दे सकती थीं: ESR ने मुक्त मूलक की पहचान बताई, ऑक्सीजन खपत ने किसी भी प्रतिदीप्त प्रोब से स्वतंत्र अभिक्रिया प्रवाह बताया, और उनके संयोजन ने दिखाया कि एक ही प्रकाशित तंत्र में सिंगलेट ऑक्सीजन और मुक्त मूलक, दोनों के निर्माण मार्ग सक्रिय थे।

1984 का वह परिणाम आज भी चेतावनी की तरह पढ़ा जाता है। प्रकाश और एक अपचायक की उपस्थिति में रंगद्रव्य ने पेरॉक्साइड उत्पन्न किया, और लौह की उपस्थिति में तंत्र ने हाइड्रॉक्सिल मुक्त मूलक बनाया, जो इस समूह की सबसे अधिक प्रतिक्रियाशील प्रजाति है। लेखकों ने इसे आँख में मौजूद एस्कॉर्बेट से जोड़ा और बिना पर्याप्त विचार के नेत्र संबंधी उपयोग पर प्रश्न उठाया। आज के पाठकों को परिस्थितियों पर ध्यान देना चाहिए: प्रकाश, अपचायक और लौह, तीनों की उपस्थिति। इनमें से किसी एक को हटाने पर यह मार्ग कमजोर पड़ता है या समाप्त हो जाता है।

ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का महत्त्व अलग कारण से है। क्लार्क प्रकार का इलेक्ट्रोड शुद्ध ऑक्सीजन खपत मापता है। इससे पुष्टि होती है कि रंगद्रव्य से संचालित रेडॉक्स प्रक्रिया आणविक ऑक्सीजन का उपभोग कर रही है, और अभिक्रिया की ऐसी गतिज जानकारी मिलती है जिसे कोई प्रतिदीप्ति संबंधी मापन-विकृति झूठा उत्पन्न नहीं कर सकती। यह उत्पाद की पहचान नहीं करता। पेरॉक्साइड, सुपरऑक्साइड और जल बनने की प्रक्रियाएँ तथा सिंगलेट ऑक्सीजन का क्षय, सभी ऑक्सीजन की खपत करते हैं। पहचान के बिना प्रवाह उतना ही अधूरा है जितना प्रवाह के बिना पहचान। इसी कारण ठोस शोधपत्र इलेक्ट्रोड को अंशांकित पेरॉक्साइड परीक्षण या ट्रैप के साथ इस्तेमाल करते हैं।

एंटीऑक्सीडेंट परिणाम परस्पर विरोधी क्यों होते हैं

इन तीन मापनों को साथ रखकर देखें, तो मेथिलीन ब्लू के साहित्य में दिखने वाले विरोधाभास विधियों के अंतर और तीन जैविक तथ्यों से स्पष्ट हो जाते हैं।

पहला, रंगद्रव्य इलेक्ट्रॉन वाहक और पेरॉक्साइड स्रोत, दोनों है। यह इलेक्ट्रॉनों को श्वसन के उन स्थलों से दूसरी ओर मोड़ सकता है जहाँ अन्यथा ऑक्सीजन सुपरऑक्साइड में बदलती। इससे एक ROS कम हो सकता है, जबकि इसका अपचयित रूप ऑक्सीजन को सीधे पेरॉक्साइड में अपचयित करके दूसरे ROS को बढ़ा सकता है। इसलिए माइटोकॉन्ड्रिया की रेडॉक्स प्रक्रिया और उसमें मेथिलीन ब्लू की वैकल्पिक मार्ग प्रदान करने वाली भूमिका का अध्ययन करने वाली प्रयोगशाला को प्रोब पर निर्भर उत्तरों की अपेक्षा करनी चाहिए: एक ही क्यूवेट में सुपरऑक्साइड-संवेदी मापन घट सकता है, जबकि पेरॉक्साइड मापन बढ़ सकता है।

दूसरा, कम मात्रा में पेरॉक्साइड केवल क्षति का कारण नहीं, एक संकेत भी है। पहले के काम के बाद चूहे के मस्तिष्क के माइटोकॉन्ड्रिया पर हुए अध्ययन में केवल पचास नैनोमोलर रंगद्रव्य से पेरॉक्साइड निर्माण पाया गया, जबकि चिकित्सीय स्तरों पर माइटोकॉन्ड्रियल DNA में क्षति नहीं मिली। पूर्व-उपचार के बाद रोटेनोन से प्रेरित क्षति के विरुद्ध सुरक्षा भी मिली। केवल एक सौ माइक्रोमोलर पर, जो चिकित्सीय सीमा से बहुत अधिक है, रंगद्रव्य ने चुने हुए DNA खंडों को क्षति पहुँचाई। वहीं लाल प्रकाश और बीस माइक्रोमोलर रंगद्रव्य ने सिंगलेट ऑक्सीजन उत्पन्न की, जिससे परीक्षण किए गए सभी खंड क्षतिग्रस्त हुए। प्रस्तावित क्रियाविधि हॉरमेसिस पर आधारित है: पेरॉक्साइड का हल्का उत्पादन Nrf2 से जुड़े एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्रों और माइटोकॉन्ड्रिया के जैवजनन को सक्रिय करता है। इस तरह अल्पकालिक ऑक्सीकरण-वर्धक मापन के बाद दीर्घकालिक एंटीऑक्सीडेंट परिणाम आता है। एक घंटे पर पढ़े गए परीक्षण और एक दिन पर पढ़े गए परीक्षण के परिणाम अलग हो सकते हैं, क्योंकि इस बीच जैविक स्थिति बदल गई।

तीसरा, प्रकाश यह भी तय करता है कि कौन-सा अणु मौजूद है। प्रकाश पड़ने पर रंगद्रव्य का डीमिथाइलेशन होता है, जिससे Azure B और संबंधित उत्पाद बनते हैं। किसी डिश के ऊपर माइक्रोस्कोप का प्रकाश भी इसे प्रकाश-संवेदी बनाने के लिए पर्याप्त है। अंधेरे और प्रकाश में किए गए प्रयोग अलग-अलग प्रयोग हैं, और किसी भी प्रोटोकॉल के प्रकाश तथा रंगद्रव्य के संचालन संबंधी नियंत्रणों वाले अनुभाग में उन्हें इसी तरह माना जाना चाहिए।

न्यूनतम नियंत्रण समूह और किसी भी दावे को समझने का तरीका

नीचे दी गई तुलना इस लेख की मूल संदर्भ सामग्री है। मेथिलीन ब्लू से जुड़े किसी भी ROS परिणाम को स्वीकार करने से पहले देखें कि लेखकों ने किस पंक्ति के नियंत्रण किए और किन्हें छोड़ दिया।

इससे परिणाम पढ़ने का एक व्यावहारिक नियम निकलता है। पेरॉक्सिडेज़ के साथ इस्तेमाल किया गया, अंशांकित और कैटालेज़ से जाँचा गया Amplex परीक्षण पेरॉक्साइड के बारे में प्रमाण देता है। DCFDA अविशिष्ट प्रोब ऑक्सीकरण के बारे में प्रमाण देता है, उससे अधिक नहीं। मुक्त मूलक निष्क्रिय करने वाले पदार्थों के नियंत्रणों के साथ स्पिन ट्रैपिंग, मुक्त मूलक की पहचान के बारे में प्रमाण देती है। ऑक्सीजन खपत प्रवाह के बारे में प्रमाण देती है। कोई वाक्य यदि अपने परीक्षण की क्षमता से अधिक दावा करता है, तो वह चाहे जितने आत्मविश्वास से लिखा गया हो, रंगद्रव्य के बजाय प्रोब के बारे में कथन है। मात्रा पर निर्भरता और हॉरमेसिस की सीमा, माइटोकॉन्ड्रिया में इलेक्ट्रॉन प्रवाह, रंजित नमूनों में परीक्षण संबंधी हस्तक्षेप, और माइक्रोस्कोपी में प्रकाश से उत्पन्न मापन-विकृतियों पर संबंधित चर्चाएँ इनमें से प्रत्येक बिंदु का विस्तार करती हैं। प्रत्येक बिंदु का अस्थायी संदर्भ बदल दिए जाने के बाद भी वह मान्य रहता है।